房克艷,趙超敏,陳 沁,鄧曉軍

(1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海200444; 2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 200135)

雄性激素和孕激素都是具有調(diào)節(jié)機(jī)體代謝或生理功能的類固醇激素,可促進(jìn)動(dòng)物生長,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成,提高蛋白轉(zhuǎn)化率。20世紀(jì)50年代雄性激素和孕激素被廣泛用作動(dòng)物生長促進(jìn)劑,以大幅度提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。然而,在飼料中濫用激素會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物組織中積累,進(jìn)而通過食物鏈進(jìn)入到人體內(nèi),干擾人體內(nèi)自然的激素平衡。勃地酮、甲睪酮等雄激素會(huì)抑制女性雌激素水平,影響孕婦胎盤功能和胎兒的生長發(fā)育[1];影響糖和脂肪的正常代謝,導(dǎo)致肥胖、高血壓等,促使心血管疾病和糖尿病的發(fā)生[2];甲羥孕酮乙酸酯、美侖孕酮等孕激素能夠刺激機(jī)體合成其它代謝類固醇如雌二醇等激素[3],進(jìn)而擾亂人體內(nèi)分泌系統(tǒng),導(dǎo)致女性性早熟、男性生育能力下降等嚴(yán)重后果[4-5]。因此,包括中國在內(nèi)的許多國家禁止了睪酮及其代謝酯、鹽類的使用[6],禁止其作為動(dòng)物生長促進(jìn)劑[7-8]。我國農(nóng)業(yè)部第176號(hào)公告也明確指出禁止使用此類激素[9]。但是在利益的驅(qū)使下,違規(guī)用藥的案例仍時(shí)有發(fā)生。因此,建立一種快速簡單的類固醇激素多殘留分析方法具有重要的實(shí)際意義。

目前,對(duì)于雄激素和孕激素的檢測(cè)研究已經(jīng)有很多,檢測(cè)對(duì)象多為動(dòng)物性產(chǎn)品[10-11]、環(huán)境基質(zhì)[12]等,檢測(cè)方法主要有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)[12]、液相色譜法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[15]。GC-MS分析樣品時(shí)必須經(jīng)過氣化,檢測(cè)雄激素和孕激素此類難揮發(fā)的物質(zhì)時(shí)需要衍生化,操作繁瑣、耗時(shí)長 。UPLC-MS/MS的方法靈敏度高,特異性強(qiáng),常用于復(fù)雜基質(zhì)中化合物的定性和定量檢測(cè)[16]。飼料前處理方法主要有:液-液萃取法(LLE)[12]、基質(zhì)固相分散萃取法(MSPD)[17]、固相萃取法(SPE)[18]、QuEChERS[19]等,相對(duì)于其它方法,LLE法的成本低且操作簡單,是提取和分離的常用方法。本文利用LLE技術(shù)、UPLC-MS/MS技術(shù),建立了飼料中8種類固醇激素的檢測(cè)方法,以期實(shí)現(xiàn)大批量飼料樣品的快速處理和檢測(cè),節(jié)省成本,提高檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

勃地酮(BND,純度98.8%)、17α-羥基孕酮(17α-OHP,純度99.4%)、甲睪酮(MTS,純度97.70%)、甲羥孕酮乙酸酯(MPA,純度99.0%)、乙酸甲地孕酮(MEGA,純度99.0%)、諾龍(NDL,純度98.1%)、群勃龍(TB,純度99.1%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司;美侖孕酮(MGA,純度98%) 加拿大TRC公司;17α-羥基孕酮-D8(17α-OHP-D8,純度99%) 加拿大CDN isotopes公司;睪酮-D3(TS-D3,純度98.68%) 美國Sigma-aldrich公司;甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈和正己烷 HPLC級(jí),美國TEDIA公司;乙酸銨、三氯乙酸、氯化鎂、氯化鋅和氫氧化鈉 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水 由Mili-Q超純水系統(tǒng)制得;Athena C18-WP色譜柱 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;飼料樣品(單一植物源性飼料、飼料添加劑、濃縮飼料配合飼料和精料補(bǔ)充料) 均購自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

超高效液相色譜配QTRAP6500質(zhì)譜 美國AB Sciex公司;IKARRVORTEX 2漩渦振蕩器 德國Heidolph公司;CM-1000往復(fù)式振蕩器 日本Yamato公司;Rotavapor R-215全自動(dòng)氮吹儀 美國Caliper公司;RE601旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司;Allegra X-30R Centrifuge低溫離心機(jī) 美國Sigma公司;Pipet-Lite XLS移液器 法國Gilson公司;BRANSON-2800超聲清洗機(jī) 美國BRANSON公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱取BND、17α-OHP、MTS、MPA、MEGA、NDL、TB和MGA 8種類固醇激素及其內(nèi)標(biāo)(17α-OHP-D8和TS-D3)各1.00 mg(精確到0.01 mg),以甲醇配制成濃度為100.0 mg/L的單標(biāo)溶液,密封,于棕色瓶中-30 ℃儲(chǔ)存。單標(biāo)中間工作液:分別移取0.1 mL 100.0 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液,以甲醇配制濃度為1.0 mg/L的單標(biāo)中間工作液,密封,于棕色瓶中-30 ℃儲(chǔ)存,備用。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:使用前分別移取一定量1.0 mg/L的8種類固醇激素的單標(biāo)中間工作液,用甲醇配制為100.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(BND、17α-OHP、MTS、MPA、MEGA、NDL、TB和MGA),密封,于棕色瓶中-4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.2 儀器分析條件 色譜條件:色譜柱為Athena C18-WP色譜柱(2.1 mm×150 mm,5 μm);流速為0.40 mL/min;進(jìn)樣體積10 μL;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨(1‰甲酸),B為乙腈(1‰甲酸);洗脫程序:0～4 min,35%～50%B;4.0～8 min,50%～85% B;8～9 min,85% B;9～9.1 min,85%～35% B;9.1～14 min,35% B。質(zhì)譜條件:電離模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電壓(IS):5500 V;霧化氣壓力(GS1):55 V;氣簾氣壓力(CUR):35 V;輔助氣流速度(GS2):60 V;離子源溫度500 ℃;碰撞氣(CAD):Medium;入口電壓(EP):10 V;所有氣體由氮?dú)馓峁?純度,99.999%),具體參數(shù)見表1。

表1 8種類固醇激素及其及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters for 8 steroid hormones and internal standards

1.2.3 樣品前處理 稱取5.00 g(精確到0.01 g)均質(zhì)飼料樣品,準(zhǔn)確加入100 μL 100.0 μg/L睪酮-D3和17α-羥孕酮-D8內(nèi)標(biāo)。加入一定量的乙腈、10%三氯乙酸,渦旋30 s,超聲提取10 min,4500 r/min離心5 min,取上清液于250 mL梨型瓶中。10 mL乙腈重復(fù)提取一次,合并提取液,于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。15 mL正己烷溶解殘余物,加入一定量的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、0.1 mol/L氯化鎂,提取溶液于10000 r/min,5 ℃離心3 min,取上清液于試管中,10 mL正己烷重復(fù)提取一次,合并的提取液在低于40 ℃下,用緩和氮?dú)饬鞔蹈伞＜尤? mL乙腈-水(1∶1,V/V)溶解殘?jiān)?加1 mL乙腈飽和正己烷溶液,渦旋混勻30 s,轉(zhuǎn)移至2 mL連蓋塑料離心管中,于4 ℃15000 r/min離心3 min,取下層溶液過0.22 μm濾膜,待測(cè)定。

1.2.4 方法優(yōu)化 質(zhì)譜條件:質(zhì)譜的離子源溫度、氣簾氣壓力、霧化氣壓力、輔助氣壓力均在所有目標(biāo)化合物都有良好響應(yīng)信號(hào)的情況下進(jìn)行優(yōu)化。采用100.0 μg/L的單標(biāo)準(zhǔn)溶液流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式,分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)(Q1)質(zhì)譜全掃描(100～500 m/z),以確定準(zhǔn)分子離子(母離子)。

色譜條件:選取Athena C18-WP色譜柱,在相同質(zhì)譜條件下,流動(dòng)相選擇水-乙腈、水-甲醇和5 mmol/L乙酸銨水-乙腈(1‰甲酸),選擇響應(yīng)值高,峰形對(duì)稱尖銳的流動(dòng)相。另外,優(yōu)化流速以及洗脫梯度,選擇響應(yīng)值高,耗時(shí)短,基質(zhì)干擾低的流速和洗脫條件。

前處理?xiàng)l件:在飼料空白樣品中添加8種類固醇激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和兩種內(nèi)標(biāo)物各1.0 μg/kg,按照1.2.3的方法進(jìn)行處理。分別考察乙腈(ACN)、乙酸乙酯(EA)和甲醇(MeOH)的提取效果并確定最佳提取溶劑的體積;選取10%的三氯乙酸(TCA)和NaOH(0.1 mol/L)溶液作為除蛋白溶劑,根據(jù)其除蛋白效果和添加回收率結(jié)果確定其添加量;比較0.1 mol/L MgCl2和0.1 mol/L ZnCl2除脂效果,選取合適的除脂溶劑和添加體積。

1.2.5 方法學(xué)考察 考察所建方法的線性范圍、檢測(cè)限、定量限、回收率、精密度、基質(zhì)效應(yīng)等指標(biāo),以評(píng)價(jià)該方法的靈敏度、回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)。

線性范圍、檢測(cè)限和定量限:配制一定系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(0、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L),分別加入1.0 μg/L定量內(nèi)標(biāo),以得到目標(biāo)物質(zhì)的峰面積與加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y),對(duì)應(yīng)目標(biāo)物質(zhì)濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度的比值為橫坐標(biāo)(x),繪制工作曲線。以3倍基線噪聲(S/N)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為該方法的檢測(cè)限(LOD),以10倍基線噪聲(S/N)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度為該方法的定量限(LOQ)。

回收率和精密度:單一植物源飼料、飼料添加劑、濃縮飼料、配合飼料和精料補(bǔ)充料空白樣品,分別添加1.0、2.0、5.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按照1.2.2和1.2.3的方法進(jìn)行檢測(cè)分析(n=6),驗(yàn)證方法的回收率和精密度。

基質(zhì)效應(yīng):選取空白基質(zhì)(5種飼料樣品)按照1.2.3的前處理方法進(jìn)行處理,得到空白基質(zhì)樣品與乙腈/水(1∶1,V/V)分別配制一定系列內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(0、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L),其中內(nèi)標(biāo)的添加量均為1.0 μg/L(n=3),得到8種類固醇激素空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k1)與乙腈/水(1∶1,V/V)配置標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率(k2)。根據(jù)以下公式,計(jì)算8種類固醇激素的基質(zhì)效應(yīng)值(Matrix effect,ME):

ME=0沒有基質(zhì)效應(yīng);ME>0離子增強(qiáng)作用;ME<0離子抑制作用。

1.2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè) 按照1.2.2和1.2.3的方法對(duì)從市場(chǎng)采購的5種飼料樣品(每種類型各10份)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采集和處理利用Analyst1.5.2軟件進(jìn)行。8種類固醇激素均采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析,具體定量情況見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

8種類固醇激素在正離子模式,且[M+H]+作為母離子時(shí)質(zhì)譜響應(yīng)值最高。因此,選擇正離子模式進(jìn)行電離。去簇電壓(Decluster potential,DP)是影響離子響應(yīng)值的重要質(zhì)譜參數(shù)。因此,首先優(yōu)化DP使每一個(gè)母離子獲得最大靈敏度,進(jìn)一步優(yōu)化其它色譜參數(shù)。以母離子為準(zhǔn)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,子離子在以氮?dú)鉃榕鲎矚獾呐鲎彩覂?nèi)獲得,選擇豐度較高的兩個(gè)特征離子碎片作為定量和定性離子(圖1)。

圖1 8種類固醇激素及其內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectrogram of 8 steriod hormones and their internal standards

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)8種類固醇激素的化學(xué)結(jié)構(gòu),選擇3組流動(dòng)相進(jìn)行比較,水-乙腈作為流動(dòng)相時(shí),8種類固醇激素的響應(yīng)值高,且在流動(dòng)相中加入甲酸,更有利于其離子化,提高其響應(yīng)值;乙酸銨的加入,可維持流動(dòng)相pH的穩(wěn)定,減少次級(jí)保留,改善峰形,使峰形更加對(duì)稱尖銳,提高積分的準(zhǔn)確度。因此,選擇5 mmol/L乙酸銨水-乙腈(1‰甲酸)為流動(dòng)相。圖2為經(jīng)梯度洗脫的二級(jí)質(zhì)譜提取離子流圖。另外,對(duì)比了流速為0.20、0.30、0.40、0.50 mL/min時(shí)的分離效果,流速過低時(shí),出峰時(shí)間晚,耗時(shí);流速為0.50 mL/min時(shí),出峰時(shí)間早,基質(zhì)影響大。最終確定流速為0.40 mL/min,此時(shí)出峰時(shí)間集中在4～8 min,且基質(zhì)影響效果小。

圖2 8種類固醇激素及其內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜提取離子流圖(1.0 μg/kg)Fig.2 MS/MS extraction ion spectra of 8 steroid hormones and two internal standards(1.0 μg/kg)

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取溶劑的選擇 由于8種類固醇激素在弱極性和中等極性的溶劑中均具有良好的溶解性。選取的3種提取溶劑在體積(均為20 mL)與前處理?xiàng)l件均相同的情況下,三者的提取回收率分別在70.6%～99.1%、38.3%～84.5%和31.4%～94.0%之間。乙腈對(duì)8種激素的提取效果均良好,甲醇對(duì)勃地酮、群勃龍、甲羥孕酮乙酸酯和乙酸甲地孕酮的提取效果不理想,而乙酸乙酯的提取效果均不理想(圖3);且甲醇提取液暴露在空氣中一段時(shí)間后,顏色由黃色變?yōu)椴菥G色,后期的凈化處理無法將其有效去除,而乙腈和乙酸乙酯提取液顏色為淺黃色,進(jìn)一步純化后,色素能夠被去除;經(jīng)甲醇提取的樣品,質(zhì)譜響應(yīng)值低,且峰形亂,表明提取液中基質(zhì)共提物較多?？紤]到回收率、基質(zhì)效應(yīng)和提取效率等綜合效果,最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖3 提取溶劑的種類對(duì)8種類固醇激素回收率的影響Fig.3 Effect of type of extraction solvent on 8 steroid hormones

2.3.2 提取溶劑體積的選擇 對(duì)比了10、15、20、25 mL的提取溶劑對(duì)回收率的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)提取劑體積為10 mL時(shí),除甲睪酮和諾龍外,其它6種激素的提取率在45%～70%之間,且峰形寬,色譜響應(yīng)值低;當(dāng)提取劑體積為15 mL時(shí),回收率均達(dá)到70%以上,峰形明顯改善,繼續(xù)增加提取溶劑的量,回收率有上升的趨勢(shì),但變化并不明顯(圖4)。為了節(jié)省有機(jī)溶劑和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時(shí)間,選擇提取溶劑體積為15 mL。

圖4 提取溶劑體積對(duì)8種類固醇激素回收率的影響 Fig.4 Effect of volume of extraction solvent on 8 steroid hormones

2.4 凈化條件的選擇

2.4.1 除蛋白條件的選擇 分別在均質(zhì)飼料中加入600 μL(A組)、700 μL(B組)、800 μL(C組)10%的三氯乙酸(TCA)。結(jié)果顯示:B組的提取液渾濁,呈現(xiàn)不透明狀,而A組和C組的提取液較清澈;濃縮后,白色殘余物的量為A>B>C;且A組樣品:有雜質(zhì)均勻的粘連在梨型瓶壁上,B、C組樣品:大部分雜質(zhì)均聚集在梨型瓶的底端。由于C組添加10% TCA的量多,蛋白迅速凝聚,部分分析物被包裹在內(nèi),造成分析物的損失;而B組樣品則是在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的過程中緩慢的發(fā)生蛋白質(zhì)的聚集,既能有效去除蛋白,又避免了分析物的大量損失。因此,選擇添加700 μL 10% TCA。

為了進(jìn)一步去除殘余蛋白,選擇添加一定量的NaOH(0.1 mol/L)。通過考察其添加量對(duì)類固醇激素回收率的影響,結(jié)果顯示:隨著NaOH添加量的增加,梨型瓶底部白色沉淀物的量逐漸增加,表明加入的NaOH溶液能夠有效的分離出殘留的蛋白。由圖5A可以看出,NaOH(0.1 mol/L)添加量對(duì)4種雄激素的影響較大,對(duì)4種孕激素回收率影響效果不明顯。NaOH添加量為0～1 mL時(shí),受樣品中蛋白質(zhì)的干擾,雄激素的回收率低,質(zhì)譜峰寬且拖尾,導(dǎo)致積分不準(zhǔn)確;添加量為2 mL時(shí),提取液呈現(xiàn)不透明狀,說明大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)被沉淀出,且此時(shí)各激素的回收率及色譜峰形均良好;繼續(xù)增加NaOH添加量,回收率效果變化不明顯。因此,選擇NaOH(0.1 mol/L)的添加量為2 mL。

圖5 NaOH(0.1 mol/L)添加量 對(duì)8種類固醇激素收率的影響Fig.5 Effect of NaOH(0.1 mol/L) addition on 8 steroid hormones

2.4.2 脫脂條件的選擇 通過比較0.1 mol/L MgCl2和0.1 mol/L ZnCl2的除脂效果,結(jié)果顯示,兩者均具有除脂效果,相比較而言,經(jīng)MgCl2除脂后,8種類固醇激素的回收率高(圖6)。表明,MgCl2能有效降低基質(zhì)的影響,提高回收率。因此,選擇MgCl2作為除脂溶劑。

圖6 MgCl2與ZnCl2對(duì)8種類固醇激素回收率影響效果的比較Fig.6 Comparison of effects of MgCl2 and ZnCl2 on 8 steroid hormones

MgCl2(0.1 mol/L)添加量不僅影響除脂效果,而且會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生一定的基質(zhì)干擾。對(duì)比結(jié)果顯示,對(duì)于雄激素,不添加MgCl2時(shí),群勃龍的回收率較低,為60%左右;隨著MgCl2添加量的增加,諾龍的回收率逐漸增加(圖7A);對(duì)于孕激素,美侖孕酮和乙酸甲地孕酮的響應(yīng)值隨著MgCl2添加量的增加而略有降低,但回收率均在70%以上,對(duì)其它幾種激素的回收率影響效果不明顯(圖7)。因此,選擇MgCl2(0.1 mol/L)添加量1 mL。

圖7 MgCl2(0.1 mol/L)添加量對(duì)8種類固醇激素回收率的影響Fig.7 Effect of MgCl2(0.1 mol/L) addition on 8 steroid hormones

以上分析可以看出,4種雄激素受蛋白質(zhì)和脂肪的影響較大,4種孕激素受其影響相對(duì)較小。蛋白質(zhì)和脂肪的去除,不僅能夠減少基質(zhì)的干擾,使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確;更重要的是,能夠減少對(duì)儀器的損傷,避免長期檢測(cè)在儀器中積累大量的蛋白質(zhì)和脂肪,堵塞管路、色譜柱,減少儀器的使用壽命。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

通過比較基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與乙腈/水(1∶1,V/V)溶劑內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。結(jié)果顯示:8種類固醇激素的ME(%)值均小于10%,且5種空白基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析的結(jié)果與用乙腈/水(1∶1,V/V)配制的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析的結(jié)果差別不大(以甲睪酮為例-圖8)。表明樣品基質(zhì)中存在一定的基質(zhì)效應(yīng),但是對(duì)分析結(jié)果的影響效果不大。

圖8 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)考察(甲睪酮為例)Fig.8 Matrix effect of LC-MS/MS(methyltestosterone as an example)

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 方法線性范圍、檢出限和定量限 該方法的線性相關(guān)系數(shù)均在0.999以上,線性關(guān)系良好。3倍基線噪聲(S/N)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度LOD為0.10～0.34 μg/kg,10倍基線噪聲(S/N)所對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度LOQ為0.35～0.98 μg/kg,與其它檢測(cè)方法相比,該方法的檢出限和檢測(cè)限低[20-21],表明該方法的靈敏度高。

2.6.2 方法回收率與精密度 單一植物源飼料、飼料添加劑、濃縮飼料、配合飼料和精料補(bǔ)充料空白樣品,分別添加1.0、2.0、5.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按照1.2.2和1.2.3的方法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行處理和檢測(cè),每個(gè)水平平行測(cè)定6次,其加標(biāo)回收率均在70.4%～109%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為0.38%～10.3%(表3)。該方法準(zhǔn)確度和精密度均符合飼料中激素殘留檢測(cè)的要求。

表3 8種類固醇激素的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Sampling recovery and relative standard deviation of 8 steroid hormones(n=6)

續(xù)表

2.7 實(shí)際樣品分析

采用所建方法對(duì)從市場(chǎng)采集的5種飼料(每種類型10個(gè)樣品)進(jìn)行檢測(cè)分析,均未檢出上述8種激素。

3 結(jié)論

本文建立了飼料樣品中4種雄性激素(勃地酮、甲睪酮、諾龍和群勃龍)和4種孕激素(甲羥孕酮乙酸酯、美侖孕酮、乙酸甲地孕酮和17α-羥基孕酮)的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法。樣品前處理采用液-液萃取的方法,操作簡單,凈化效果好,能有效地降低基質(zhì)效應(yīng);可在14 min實(shí)現(xiàn)8種類固醇激素的檢測(cè)分析,與普通的液相色譜方法相比,分離效果好,分析時(shí)間短,檢出限和定量限低,精密度高;該方法的回收率和線性均符合檢測(cè)的要求。該方法可靠、快速,靈敏度高,可作為飼料中8種類固醇激素的確證和定量方法。