郭榮燦,王成華,江虹銳,余 煉,劉小玲,*,趙謀明,2,*

(1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004; 2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510641)

竹筍是一種傳統(tǒng)食材,被廣泛應(yīng)用于我國(guó)、印度及東南亞國(guó)家的菜肴烹煮中[1-3]。發(fā)酵竹筍是針對(duì)鮮竹筍儲(chǔ)藏困難的問題而誕生的自然發(fā)酵產(chǎn)物。在廣西,發(fā)酵酸筍是重要的食物原料。酸筍一個(gè)重要的特征就是其發(fā)酵酸味,該氣味具有很強(qiáng)的地區(qū)嗜好性,對(duì)其推廣產(chǎn)生了阻礙。對(duì)酸筍氣味組成進(jìn)行研究,有利于對(duì)發(fā)酵酸筍進(jìn)行性能改良、品質(zhì)控制以及按嗜好進(jìn)行市場(chǎng)細(xì)分,對(duì)推廣地區(qū)特色產(chǎn)品有很大的意義。

隨著檢測(cè)儀器和技術(shù)的不斷進(jìn)步,氣味成分的提取濃縮技術(shù)也在不斷豐富。常見的氣味物質(zhì)提取方法有液液萃取法(LLE)、同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)、頂空固相微萃取法(HS-SPME)等。LLE操作簡(jiǎn)單,但是耗時(shí)長(zhǎng),該方法也用于非揮發(fā)性物質(zhì)的提取[4],可能會(huì)引入非揮發(fā)性化合物,從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。SDE法是通過同時(shí)加熱樣品及萃取溶劑,使揮發(fā)組分與溶劑蒸氣混合,從而達(dá)到萃取的目的,該方法對(duì)含量低的揮發(fā)成分萃取效果較好,但需要保持沸騰,很容易造成氣味物質(zhì)的變化[5]。頂空固相微萃取法不需要高溫加熱,實(shí)驗(yàn)裝置簡(jiǎn)單,但萃取物質(zhì)類型易受到萃取頭涂層種類的影響[6]。目前,對(duì)廣西發(fā)酵酸筍氣味的研究匱乏,提取方法各有優(yōu)劣,用何種方法提取氣味物質(zhì)效果最好尚無研究結(jié)論。本文使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分別對(duì)LLE、SDE、HS-SPME法提取的發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的萃取峰面積和萃取物質(zhì)種類進(jìn)行優(yōu)化和比較,旨在尋找最優(yōu)的氣味物質(zhì)提取方法,為進(jìn)一步展開深入的風(fēng)味研究提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵酸筍樣品及其發(fā)酵液 廣西南寧市五里亭菜市場(chǎng);氯化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;二氯甲烷、正己烷 天津富宇精細(xì)化工有限公司、乙醚 江蘇沭陽(yáng)恒潤(rùn)精細(xì)化工有限公司;以上試劑 均為分析純。

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-Wax彈性石英毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Agilent公司;Milli-Q水凈化系統(tǒng) 德國(guó)Merck公司;75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭、85 μm PA固相微萃取頭、100 μm PDMS固相微萃取頭、65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭、手動(dòng)固相微萃取握柄 美國(guó)Supelco公司;HY-5A回旋式振蕩搖床 常州朗越儀器制造有限公司;JYL-C16V食品研磨機(jī) 山東九陽(yáng)股份有限公司;RCT B S025數(shù)顯恒溫磁力攪拌裝置、T25 digital均質(zhì)機(jī) 美國(guó)IKA公司;LG10-2.4A離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;5418 R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;DZTW調(diào)溫加熱套 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LLE法提取發(fā)酵酸筍香氣物質(zhì)及條件優(yōu)化

1.2.1.1 香氣物質(zhì)的提取 參考馮云子[7]的LLE條件,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下:將50 g酸筍通過食品研磨機(jī)粉碎成糊,與50 mL發(fā)酵酸液混合后,置于1000 mL錐形瓶中。加入100 mL鹽水與100 mL萃取劑,在振蕩搖床上振蕩20 h后,通過分液漏斗取有機(jī)層,置于500 mL錐形瓶中。加入適量無水硫酸鈉除水,用保鮮膜封口后,于振蕩搖床上振蕩1 h,之后通過濾紙過濾。使用注射器將1 mL濾液通過0.22 μm有機(jī)相膜過濾到GC-MS進(jìn)樣瓶(2 mL)中,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.1.2 萃取溶劑的選擇 由于溶劑對(duì)萃取效果有一定的影響,故分別采用二氯甲烷(極性)、乙醚(極性)、正己烷(非極性)按照初始條件,添加17.00%氯化鈉溶液,對(duì)萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類進(jìn)行對(duì)比。

1.2.1.3 樣品離子濃度的優(yōu)化 適量的氯化鈉溶解在水中會(huì)增加樣品的離子濃度,從而降低揮發(fā)性化合物在水中的溶解度,促進(jìn)其向有機(jī)相溶劑的傳質(zhì)過程。以初始條件為基礎(chǔ),使用最佳溶劑作為溶劑,分別添加0.00%、17.00%、飽和氯化鈉溶液,對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.2 SDE法提取發(fā)酵酸筍香氣物質(zhì)及條件優(yōu)化

1.2.2.1 香氣物質(zhì)的提取 參考馮云子[7]的SDE條件,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下:將50 g酸筍通過食品研磨機(jī)粉碎成糊,與50 mL發(fā)酵酸液混合后置于 500 mL圓底燒瓶中,加入一定量的氯化鈉溶液稀釋樣品,連接在同時(shí)蒸餾萃取裝置上,通過加熱套加熱并保持微沸。另在250 mL圓底燒瓶中添加100 mL萃取溶劑,連接在同時(shí)蒸餾裝置上后,通過恒溫水浴鍋保持溶劑微沸。連續(xù)提取一定時(shí)間后,冷卻至室溫,取有機(jī)相部分置于500 mL錐形瓶中。加入適量無水硫酸鈉,用保鮮膜封口后于振蕩搖床上振蕩1 h,之后通過濾紙過濾。使用注射器將1 mL濾液通過0.22 μm有機(jī)相膜過濾到GC-MS進(jìn)樣瓶(2 mL)中,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2.2 萃取溶劑的選擇 在初始條件的基礎(chǔ)上,使用100 mL 17.00%氯化鈉溶液稀釋樣品后,分別使用二氯甲烷(水浴溫度45 ℃)、乙醚(水浴溫度40 ℃)、正己烷(水浴溫度75 ℃)作為萃取溶劑,萃取時(shí)間為2 h,對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.2.3 樣品離子濃度的優(yōu)化 以初始條件為基礎(chǔ),分別添加100 mL的0.00%、17.00%、飽和氯化鈉溶液稀釋樣品,使用最佳溶劑作為萃取劑,萃取時(shí)間為2 h,對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.2.4 稀釋液添加量的優(yōu)化 由于同時(shí)蒸餾萃取法涉及樣品的加熱,如不對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,加熱過程中可能會(huì)造成樣品焦糊,影響萃取效果,故在初始條件的基礎(chǔ)上,分別添加50、100、150及200 mL的最佳濃度氯化鈉溶液,使用最佳溶劑作為萃取劑,萃取時(shí)間為2 h,對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.2.5 萃取時(shí)間的優(yōu)化 在以上條件均選取最佳萃取條件后,分別對(duì)比萃取1、2、3及4 h的萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.3 HS-SPME萃取法提取發(fā)酵酸筍香氣物質(zhì)及條件優(yōu)化

1.2.3.1 香氣物質(zhì)的提取 參考Kim等[8]的HS-SPME實(shí)驗(yàn)條件,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:樣品前處理:將100 g發(fā)酵酸筍固體經(jīng)食品研磨機(jī)粉碎后與100 mL發(fā)酵酸液混合,在冰水浴下通過均質(zhì)機(jī)以8000 r/min均質(zhì)1 min。勻漿放入離心管中,以5000 r/min離心15 min后取上清液,再經(jīng)10000 r/min離心30 min,放入樣品瓶中備用。

萃取:取樣液3 mL放入15 mL頂空樣品瓶,與等體積超純水混合,加入氯化鈉和磁力轉(zhuǎn)子,于300 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌,水浴平衡30 min,分別使用經(jīng)過老化的萃取頭萃取一定時(shí)間后,通過手動(dòng)進(jìn)樣口進(jìn)樣,在250 ℃下釋放5 min,通過GC-MS測(cè)定結(jié)果。

1.2.3.2 萃取針頭的選擇 本實(shí)驗(yàn)篩選了四種具有不同固定相涂層的萃取頭,分別為85 μm PA(Polyacrylate,聚丙烯酸酯,強(qiáng)極性)、75 μm CAR/PDMS(Carboxen/Polydimethylsiloxane,碳分子篩/聚二甲硅氧烷,中極性)、65 μm PDMS/DVB(Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene,聚二甲硅氧烷/二乙烯基苯,中極性)、100 μm PDMS(Polydimethylsiloxane,聚二甲硅氧烷,非極性),在樣品中加入0.60 g氯化鈉,于50 ℃下萃取30 min。萃取頭使用一臺(tái)氣相色譜柱進(jìn)樣口作為老化裝置,使用氮?dú)獯祾弑３汁h(huán)境惰性,老化時(shí)間及溫度按照Supelco公司的推薦條件進(jìn)行,具體見表1。

表1 固相微萃取頭的老化溫度和時(shí)間Table 1 Aging temperature and time for SPME fiber

1.2.3.3 樣品離子濃度的優(yōu)化 使用最佳萃取頭,在樣品中分別加入相當(dāng)于樣品質(zhì)量0%(0.00 g)、1%(0.60 g)、2%(1.20 g)、3%(1.80 g)氯化鈉,于50 ℃下萃取30 min。對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.3.4 萃取溫度的優(yōu)化 使用最佳萃取頭,在樣品中加入最佳添加量的氯化鈉,分別于30、40、50、60 ℃下萃取30 min,對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.3.5 萃取時(shí)間的優(yōu)化 在上述最佳條件下分別萃取10、20、30、40 min,對(duì)比萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類。

1.2.4 揮發(fā)性成分的GC-MS測(cè)定 GC條件:色譜柱使用DB-Wax(60 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣器溫度250 ℃,LLE及SDE法樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣1 μL,溶劑延遲8 min;HS-SPME法為手動(dòng)進(jìn)樣,解吸時(shí)間為5 min。柱箱升溫程序:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min的速度上升到120 ℃,保持2 min,再以7 ℃/min的速度上升到220 ℃,保持5 min,最后以7 ℃/min的速度上升到240 ℃,保持5 min。

MS條件:質(zhì)譜條件為傳輸線溫度250 ℃。離子能級(jí)70 ev,采用SCAN(全掃描)模式,掃描質(zhì)荷比范圍為35～395。LLE及SDE法樣品設(shè)置3 min的溶劑延遲。

定性與定量方法:色譜圖通過MassHuter軟件積分并與NIST14譜庫(kù)比對(duì),取匹配度在80%以上的物質(zhì)進(jìn)行分析。通過積分法計(jì)算絕對(duì)峰面積,并通過峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩次平行實(shí)驗(yàn),峰面積數(shù)據(jù)以平均值形式表示,提取物質(zhì)總數(shù)數(shù)據(jù)取平行組中最大值,相對(duì)含量以百分比形式呈現(xiàn)。數(shù)據(jù)通過SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算,總離子流圖通過Origin軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 LLE法的萃取效果及條件優(yōu)化

2.1.1 不同溶劑對(duì)LLE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 正己烷、乙醚和二氯甲烷3種不同極性溶劑在LLE法中對(duì)酸筍中揮發(fā)性成分的萃取效果如表2所示。由表2可知,不同溶劑萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積由大到小分別為:乙醚>正己烷>二氯甲烷。而萃取物質(zhì)種類由多至少分別為:乙醚>二氯甲烷>正己烷。非極性溶劑正己烷的萃取總峰面積雖較極性溶劑二氯甲烷大,但其萃取的物質(zhì)種類少于兩種極性溶劑,推測(cè)與相似相溶原理有關(guān),在醬油的香味成分萃取上也存在香味物質(zhì)以極性物質(zhì)為主的情況[7]。故考慮到萃取物質(zhì)的多樣性,正己烷并不適合作為發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的萃取溶劑使用。而在極性溶劑方面,極性較強(qiáng)的乙醚無論是萃取總峰面積還是物質(zhì)總類優(yōu)于二氯甲烷。綜上所述,乙醚是通過液液萃取法萃取酸筍揮發(fā)性氣味成分的最佳溶劑。

表2 不同溶劑對(duì)LLE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 2 Effect of different solvents on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by LLE

2.1.2 不同樣品離子濃度對(duì)LLE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 向樣品中添加0.00%、17.00%和飽和氯化鈉溶液在LLE法中對(duì)酸筍中揮發(fā)性成分的萃取效果如表3所示。從表3可以看出,隨著氯化鈉溶液濃度由增加0%增加至飽和,萃取總峰面積由4.22×109Ab·s逐漸增加至6.76×109Ab·s,而提取物質(zhì)總數(shù)也由29增加至34種。這與增加離子強(qiáng)度會(huì)抑制揮發(fā)性物質(zhì)在水相中的溶解度的理論符合[9],故采取添加飽和氯化鈉溶液作為最佳離子濃度條件。

表3 不同離子濃度對(duì)LLE萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 3 Effect of different salt concertrations on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by LLE

2.2 SDE法的萃取效果及條件優(yōu)化

2.2.1 不同溶劑對(duì)SDE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 正己烷、乙醚和二氯甲烷3種不同極性溶劑在SDE法中對(duì)酸筍中揮發(fā)性成分的萃取效果如表4所示。由表4可知,不同溶劑萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積由大到小分別為:二氯甲烷>乙醚>正己烷。而萃取物質(zhì)種類由多至少分別為:二氯甲烷>乙醚>正己烷。極性溶劑正己烷萃取在總峰面積和物質(zhì)種類方面均劣于非極性溶劑,故非極性溶劑正己烷并不適合作為SDE法萃取發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的萃取溶劑。在極性萃取溶劑方面,乙醚的萃取物質(zhì)總峰面積(6.64×108Ab·s)和萃取的物質(zhì)種類(19種)均少于二氯甲烷(1.09×109Ab·s,22種)。推測(cè)原因?yàn)镾DE法中的萃取過程為將樣品與溶劑同時(shí)加熱,揮發(fā)性成分在通過加熱后以氣態(tài)形式與溶劑蒸氣混合,故最終萃取液中不包含難揮發(fā)性組分,而在LLE過程中則由于樣品與萃取液的直接接觸,造成了難揮發(fā)性成分能夠從水相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相,LLE中萃取的物質(zhì)種類普遍多于SDE的原因也可以解釋為此。因此在SDE法萃取實(shí)驗(yàn)中,二氯甲烷的萃取效果優(yōu)于乙醚,這與通過SDE法萃取豆瓣醬和東方鲀的氣味物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10-11]。綜上所述,二氯甲烷是通過同時(shí)蒸餾萃取法萃取酸筍揮發(fā)性氣味成分的最佳溶劑。

表4 不同有機(jī)溶劑對(duì)SDE萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 4 Effect of different organic solvents on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.2.2 不同樣品離子濃度對(duì)SDE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 向樣品中添加0.00%、17.00%和飽和氯化鈉溶液在SDE法中對(duì)酸筍中揮發(fā)性成分的萃取效果如表5所示。從表5可以看出,與LLE實(shí)驗(yàn)中鹽含量變化引起萃取效果變化的規(guī)律類似,隨著氯化鈉溶液濃度的增加,無論是物質(zhì)種類還是物質(zhì)總質(zhì)量均在上升,在飽和食鹽水中達(dá)到最佳(1.62×109Ab·s,24種),故采取添加飽和氯化鈉溶液作為最佳離子濃度條件。

表5 不同離子濃度對(duì)SDE萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 5 Effect of different salt concertrations on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.2.3 不同稀釋液添加量對(duì)SDE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 向樣品里添加50、100、150、200 mL的飽和氯化鈉溶液,對(duì)萃取效果的影響如表6所示。從表6可以看出,當(dāng)添加的稀釋液體積為50 mL時(shí),其萃取的物質(zhì)總數(shù)為23種,僅比最多的100 mL組少1種,且萃取的物質(zhì)總質(zhì)量(以總峰面積表示)最高(1.95×109Ab·s)。由于SDE法的樣品涉及保持沸騰狀態(tài)的加熱過程,如不添加一定量的稀釋液稀釋樣品,會(huì)造成樣品焦糊。在實(shí)驗(yàn)過程中,50 mL組在萃取后期出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象,萃取樣品也散發(fā)著焦糊氣味,故其總峰面積大可能是由于稀釋不足,發(fā)生焦糊現(xiàn)象時(shí)產(chǎn)生了新的不良?xì)馕段镔|(zhì)引起的,因此該稀釋液添加量不適合進(jìn)行SDE萃取。在未發(fā)生焦糊現(xiàn)象的組(100～200 mL)中,隨著飽和氯化鈉溶液添加量的增加,萃取物質(zhì)的總峰面積在從1.61×109Ab·s逐漸下降到9.26×108Ab·s,萃取的物質(zhì)總數(shù)也從24種減少到22種,這說明當(dāng)加入150 mL或更多飽和氯化鈉溶液后,稀釋液體積過大造成樣品被過分稀釋,影響了萃取效果。綜上所述,100 mL為SDE法最適氯化鈉溶液添加量。

表6 不同稀釋液添加量對(duì)SDE萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 6 Effect of different volumes of diluent on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.2.4 不同樣品萃取時(shí)間對(duì)SDE萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 對(duì)樣品進(jìn)行1、2、3、4 h的提取,萃取效果如表7所示。從表7中可以看出,萃取時(shí)間為1 h的樣品萃取物質(zhì)總峰面積及提取出的物質(zhì)總數(shù)均最少(7.47×108Ab·s,20種),說明1 h的萃取時(shí)間明顯不足,揮發(fā)性物質(zhì)與溶劑蒸氣混合時(shí)間短,難以完全萃取揮發(fā)性成分。理論上同時(shí)蒸餾萃取過程由于萃取液蒸氣和水蒸氣的冷卻回流,萃取液和樣品水溶液的總量在裝置中維持不變,提取過程是無損失的循環(huán)過程,故延長(zhǎng)提取時(shí)間可以增加揮發(fā)性物質(zhì)和萃取劑蒸氣的混合次數(shù),從而增加提取效果[12],但在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中由于密封條件無法完全達(dá)到理論狀態(tài),水蒸氣和萃取溶劑蒸氣會(huì)少量泄露,經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)有可能造成樣品焦糊或有機(jī)萃取溶劑不足的狀態(tài),且長(zhǎng)時(shí)間的加熱過程可能會(huì)破壞揮發(fā)性氣味物質(zhì)。在萃取時(shí)間超過2 h的情況下,隨著時(shí)間的增加,總峰面積保持在1.62×109Ab·s左右,2～3 h提取物質(zhì)總數(shù)的變化并不明顯(24種),在加熱4 h的時(shí)候提取出的物質(zhì)總數(shù)還減少了1種。故可以看出,提取2 h已經(jīng)可以較為充分地提取出酸筍樣品中的揮發(fā)性成分,故最佳萃取時(shí)間選擇為2 h。

表7 不同萃取時(shí)間對(duì)SDE萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 7 Effect of different extraction time on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by SDE

2.3 HS-SPME法的萃取效果與條件優(yōu)化

2.3.1 不同萃取頭對(duì)HS-SPME萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 四種不同涂層的萃取頭進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對(duì)比萃取效果,結(jié)果如表8所示。由表8可以看出,強(qiáng)極性萃取頭PA總峰面積較高,中極性萃取頭PDMS/DVB和CAR/PDMS的萃取總峰面積次之,非極性萃取頭PDMS萃取總峰面積最低。從萃取的物質(zhì)總數(shù)來說,PDMS/DVB的萃取效果最好(39種),較PA萃取頭多了11種,從萃取效果完整性方面考慮,選擇65 μm PDMS/DVB為最佳萃取頭。

表8 不同萃取頭對(duì)HS-SPME萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 8 Effect of different SPME fibers on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

2.3.2 不同樣品離子濃度對(duì)HS-SPME萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 由于向水相溶液中添加鹽離子,可以通過增加離子強(qiáng)度,降低疏水性化合物在水中的溶解度,促進(jìn)其析出,故在HS-SPME實(shí)驗(yàn)中通常都會(huì)添加一定量的氯化鈉以增加萃取效果[13]。本實(shí)驗(yàn)中研究了向樣品中分別加入相當(dāng)于樣品質(zhì)量0%(0.00 g)、1%(0.60 g)、2%(1.20 g)、3%(1.80 g)氯化鈉對(duì)萃取效果的影響。由表9可知,在添加氯化鈉量為0.00～1.20 g之間時(shí),隨著添加氯化鈉質(zhì)量的上升,總峰面積由1.88×109Ab·s上升至3.21×109Ab·s,萃取的物質(zhì)總數(shù)也由38種上升至41種,而在將氯化鈉添加量增加至1.80 g時(shí),萃取效果(3.21×109Ab·s,41種)與1.20 g時(shí)(3.23×109Ab·s,41種)相差不大。故可知在添加氯化鈉質(zhì)量為1.20 g時(shí),已經(jīng)達(dá)到了將酸筍中的揮發(fā)性物質(zhì)通過HS-SPME萃取出來的萃取效果。根據(jù)在醬油方面的對(duì)HS-SPME與鹽濃度的研究[7],當(dāng)氯化鈉濃度上升到一定濃度,會(huì)對(duì)部分揮發(fā)性物質(zhì),特別是小分子揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生抑制作用,如繼續(xù)增加氯化鈉濃度有降低萃取效果的可能,故在此選擇1.20 g作為最佳氯化鈉添加量。

表9 不同離子濃度對(duì)SPME萃取 酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 9 Effect of different salt concertrations on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

2.3.3 不同萃取溫度對(duì)HS-SPME萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 本實(shí)驗(yàn)分別在30、40、50及60 ℃進(jìn)行萃取,對(duì)比萃取效果,結(jié)果如表10所示。由表10所示,萃取溫度由30 ℃上升到50 ℃之間時(shí),萃取總峰面積由2.23×109Ab·s上升至3.20×109Ab·s,提取出的物質(zhì)總數(shù)由34種上升至41種。但當(dāng)萃取溫度上升到60 ℃時(shí)(3.22×109Ab·s,41種),萃取效果相較于50 ℃時(shí)(3.20×109Ab·s,41種)沒有明顯的變化。HS-SPME通過加熱使樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)析出,分散在樣品上方的空氣中,再通過萃取頭吸附揮發(fā)性物質(zhì),在這個(gè)過程中,萃取溫度的提高對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的析出有加速作用,且部分揮發(fā)性物質(zhì)必需達(dá)到一定的溫度才能充分揮發(fā),故過低的溫度會(huì)降低萃取效果,而過高的溫度會(huì)造成頂空部分水蒸氣含量過高,加速萃取頭使用壽命的損耗。故可以得知,在進(jìn)行HS-SPME萃取時(shí),萃取溫度達(dá)到50 ℃時(shí),已經(jīng)足以對(duì)發(fā)酵酸筍的揮發(fā)性組分進(jìn)行充分的萃取。

表10 不同萃取溫度對(duì)HS-SPME 萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 10 Effect of different extraction temperatures on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

2.3.4 不同萃取時(shí)間對(duì)HS-SPME萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響 在本實(shí)驗(yàn)中在采取上述實(shí)驗(yàn)選取出的最佳條件下,分別對(duì)樣品分別萃取10、20、30、40 min,對(duì)比萃取效果,結(jié)果如表11所示。灌服狹果茶藨子果實(shí)乙酸乙酯萃取物Ⅱ低、中劑量由表11可知,隨著溫度提取時(shí)間的增加,在30 min時(shí)提取物質(zhì)的總峰面積達(dá)到3.21×109Ab·s,提取出的物質(zhì)總數(shù)為41種,再繼續(xù)增加提取時(shí)間至40 min,提取物質(zhì)總峰面積為3.23×109Ab·s,相較30 min時(shí)增加并不多,而物質(zhì)種類沒有增加,說明提取時(shí)間為30 min已充分提取揮發(fā)性物質(zhì)。

表11 不同萃取時(shí)間對(duì)HS-SPME 萃取酸筍揮發(fā)性物質(zhì)效果的影響Table 11 Effect of different extraction time on extraction efficiencies of volatile compounds from bamboo shoots by HS-SPME

足夠的萃取時(shí)間可以讓固相微萃取頭與頂部空氣進(jìn)行充分傳質(zhì),直到達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡則萃取完全,故一定的萃取時(shí)間是必要的。但由于用于萃取的樣品酸筍液水分含量較高,萃取過程中會(huì)產(chǎn)生大量水蒸氣,長(zhǎng)時(shí)間令萃取頭暴露在有水蒸氣的環(huán)境中,會(huì)加速萃取頭使用壽命的損耗,故萃取時(shí)間在萃取充分的條件下也應(yīng)該盡量縮短。故選擇30 min作為最佳提取時(shí)間。

2.4 不同提取方法對(duì)酸筍揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取效果的比較分析

由2.1～2.3中的結(jié)論,分別采用LLE、SDE及HS-SPME的最佳條件進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)。3種萃取方法的萃取物質(zhì)詳表如表12,總離子流圖如圖1。

表12 不同提取方法酸筍揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果比較Table 12 The comparison results of volatile compounds from fermented bamboo shoots by different extraction methods

續(xù)表

續(xù)表

由表12可知,萃取物質(zhì)峰面積最大為L(zhǎng)LE法,HS-SPME法次之,最后是SDE法,萃取物質(zhì)種類由多到少順序則為HS-SPME法、LLE法、SDE法。無論是萃取物質(zhì)峰面積還是萃取物質(zhì)種類,均為SDE法效果最不理想。

相較于其他兩法,通過LLE法萃取的物質(zhì)中,雜環(huán)類化合物相對(duì)含量最高(29.28%),一些雜環(huán)物質(zhì)具有氣味活性如吡嗪、呋喃,但在本實(shí)驗(yàn)LLE法萃取出的雜環(huán)化合物中,含量最高的為2-甲基苯并[e]茚、1,2-二氫-10-甲基-蒽、1,6,7-三甲基-萘等高沸點(diǎn)的化合物,揮發(fā)性較差,對(duì)氣味物質(zhì)貢獻(xiàn)有限。烷烴類化合物種類較多(18種),占到了其萃取物質(zhì)總數(shù)(34種)的一半以上,而該種物質(zhì)的相對(duì)含量為第二,占到了28.50%,其中含有大量高碳數(shù)的烷烴,沸點(diǎn)較高。根據(jù)酒類、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵調(diào)味品及發(fā)酵泡菜等其他發(fā)酵食品氣味的研究[14-17],烷烴類化合物由于大多數(shù)沸點(diǎn)較高或嗅聞閾值較高,在食品當(dāng)中難以覺察,對(duì)氣味貢獻(xiàn)較小。而醇(1種)、酚(2種)、酸(3種)、烯(2種)等物質(zhì)種類較少,這幾類物質(zhì)的相對(duì)含量均小于以上兩種物質(zhì),相對(duì)含量之和為42%,而該類物質(zhì)則通常作為對(duì)呈味起貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)存在[14-17]。這可能是由于LLE法引入了過多的非揮發(fā)性物質(zhì),故在GC-MS分離鑒定過程中掩蓋了含量較少的揮發(fā)性氣味物質(zhì)。而另外兩法在原理上通過萃取以氣態(tài)形式存在的揮發(fā)性物質(zhì),沒有直接與樣品接觸,沒有出現(xiàn)這一問題。

SDE法萃取出的物質(zhì)中相對(duì)含量最高的為酚類(35.71%)、醇類次之(23.44%),再到酸類(17.85%)和酯類(16.04%),合計(jì)達(dá)到93.04%。同上文所述,這幾類物質(zhì)常被認(rèn)為對(duì)氣味貢獻(xiàn)較大。在SDE萃取的這幾類物質(zhì)中,含量較高的對(duì)甲酚、乙酸、3-呋喃甲醇等均是常見被報(bào)道的呈味物質(zhì)。

HS-SPME法萃取物質(zhì)峰面積相對(duì)較大,萃取出的物質(zhì)種類最為豐富,且其中有著起氣味貢獻(xiàn)作用潛力的醇(5種)、酚(6種)、酸(5種)、烯(6種)、酯(6種)類物質(zhì)較多,相對(duì)含量由多至少依次為酚(68.13%)、酸(15.03%)、醇(14.22%)及其他,前3類物質(zhì)的相對(duì)含量達(dá)到了97.38%,其中含量較高的對(duì)甲酚、苯酚、乙酸、乙醇均是發(fā)酵食品中常見的氣味物質(zhì)[14-17]。

可見對(duì)于揮發(fā)性物質(zhì)的萃取效果上,LLE法雖然獲取的峰面積最大,但其萃取出的物質(zhì)中氣味貢獻(xiàn)度較低的高沸點(diǎn)雜環(huán)類和烷烴類所占比例較高,而SDE法和HS-SPME法萃取物質(zhì)種類則更多地集中在氣味貢獻(xiàn)度較高的強(qiáng)揮發(fā)性低沸點(diǎn)物質(zhì)上。

對(duì)比圖1可以明顯看出,自25 min開始直至結(jié)束,LLE對(duì)應(yīng)的總離子流色譜圖(圖1A)上出現(xiàn)較多雜峰,該現(xiàn)象并未在另外兩組色譜圖(圖1B、C)中出現(xiàn),同時(shí)LLE萃取的萃取液相較于SDE萃取得到的樣液顏色偏黃,故認(rèn)為在萃取過程中由于LLE法為萃取液與樣品液直接接觸,除含量偏少的揮發(fā)性氣味物質(zhì)外,LLE法也將諸如色素等含量更高的非揮發(fā)性有機(jī)物萃取了出來,引起了雜峰偏多現(xiàn)象,這與前文中LLE法萃取物質(zhì)中非氣味貢獻(xiàn)物質(zhì)種類較多的情況相對(duì)應(yīng)。這些雜峰的引入會(huì)掩蓋目標(biāo)物質(zhì)在色譜圖中的分離效果,同時(shí)也降低了質(zhì)譜系統(tǒng)的鑒定精確度,這也就能解釋為何通過LLE法獲得的總峰面積最大,但通過質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確度高于80%的物質(zhì)數(shù)低于HS-SPME法。

圖1 LLE、SDE及HS-SPME法 提取酸筍氣味物質(zhì)總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of fermented bamboo shoots volatiles obtained by LLE,SDE and HS-SPME注:A圖為L(zhǎng)LE法總離子流圖;B圖為SDE法總離子流圖; C圖為HS-SPME法總離子流圖。

綜上所述,LLE法萃取物質(zhì)種類多,總峰面積最大,但對(duì)氣味起貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)相對(duì)含量偏低;SDE法萃取的物質(zhì)中對(duì)氣味起貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)相對(duì)含量較高,但其萃取物質(zhì)種類和總峰面積均在三法中最低;HS-SPME法萃取物質(zhì)種類最多,總峰面積大,且萃取物質(zhì)種類集中在對(duì)氣味起貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)上,故認(rèn)為HS-SPME法是萃取發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的最佳方法。

3 結(jié)論

本研究主要優(yōu)化了LLE、SDE、HS-SPME法在萃取發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)方面的最佳萃取條件,并通過對(duì)比3種方法的萃取效果,選擇最佳的萃取發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的方法,結(jié)論如下:LLE法使用乙醚作為提取溶劑,稀釋液使用飽和氯化鈉溶液提取效果最佳。SDE法采用二氯甲烷作為提取溶劑,稀釋液采用100 mL飽和氯化鈉溶液,提取2 h效果最佳。HS-SPME法采用65 μm PDMS/DVB萃取頭,添加1.2 g氯化鈉,在50 ℃下水浴萃取30 min萃取效果最佳。各萃取法使用以上條件,可使得萃取峰面積及萃取物質(zhì)種類達(dá)到最大。對(duì)比3種萃取方法,由于LLE法直接接觸樣品液,傳質(zhì)效果好,萃取物質(zhì)峰面積最大(5.16×109Ab·s),且萃取物質(zhì)種類多(34種),但其中對(duì)氣味貢獻(xiàn)作用低的高沸點(diǎn)雜環(huán)類和烷烴類物質(zhì)所占比重較大(相對(duì)含量達(dá)到57.78%);而SDE法萃取物質(zhì)集中在對(duì)氣味貢獻(xiàn)度較高的酚、醇、酸、酯類物質(zhì)上(相對(duì)含量達(dá)到93.04%),但其峰面積最小(1.61×109Ab·s),萃取物質(zhì)種類最少(24種);HS-SPME對(duì)揮發(fā)性成分的萃取峰面積較高(3.20×109Ab·s),同時(shí)該法萃取的物質(zhì)種類最為豐富(41種),且其中酚、酸、醇類物質(zhì)相對(duì)含量高(97.38%),故HS-SPME法為萃取發(fā)酵酸筍氣味物質(zhì)的最佳方法。