崔冠軍,程 超,單文山,王 俊,萬(wàn)云鵬,李 磊,尹宗生
骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種進(jìn)行性關(guān)節(jié)退變疾病,其主要特征是合成代謝失衡與細(xì)胞外基質(zhì)降解[1]。在OA病理生理過(guò)程中,滑膜病變起著重要的作用[2]?;そM織主要功能細(xì)胞為滑膜成纖維樣細(xì)胞(fibroblast- like synoviocytes,F(xiàn)LS)[3],它能夠被炎癥細(xì)胞因子白介素- 1β(interleukin 1 beta,IL- 1β)活化,產(chǎn)生與OA相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase- 1,MMP- 1)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase- 13,MMP- 13)[4]。另外,IL- 1β也能夠通過(guò)上調(diào)FLS中環(huán)加氧酶- 2(cyclooxygenase- 2,COX- 2)的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)前列腺素E2[prostaglandin E(2),PGE2]的產(chǎn)生,從而在OA發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[5]。PGE2能夠增加基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和其他分解代謝物質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)影響關(guān)節(jié)組織的結(jié)構(gòu)和功能[6]。乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)作為一種鐵結(jié)合性糖蛋白,具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗氧化、抗炎等作用[7]。因此,本實(shí)驗(yàn)依據(jù)乳鐵蛋白抗炎的特性,來(lái)研究LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)的人OA滑膜細(xì)胞MMP1、MMP13、COX- 2、PGE2產(chǎn)生的影響,為OA治療方法提供參考。
1.1 試劑與儀器乳鐵蛋白(上海西寶生物技術(shù)公司);胎牛血清(美國(guó)clark公司)、DMEM 高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司); 胰酶細(xì)胞消化液(上海Beyotime公司);鏈霉素-青霉素(上海Beyotime公司);CCK- 8試劑(七海生物技術(shù)公司);TRIzol Reagent(美國(guó)ambion公司);PCR試劑盒(南京Vazyme公司);MMP- 1、MMP- 13、COX- 2、GAPDH 引物序列(上海生工生物工程有限公司);MMP1、MMP13、COX- 2抗體(武漢Elabscience公司);波形蛋白(Vimentin,VM)抗體(上海Beyotime公司);Goat Anti- Rabbit IgG(H+L)(Alexa Fluor594 conjugated)(武漢Elabscience公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);酶標(biāo)儀(武漢優(yōu)爾生科技股份公司);基因擴(kuò)增儀(型號(hào):TC- XP,杭州博日科技有限公司);凝膠成像掃描系統(tǒng)(美國(guó)RAD公司)。
1.2 OA滑膜組織來(lái)源滑膜取自2017年11月~2018年6月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科OA行膝關(guān)節(jié)置換的患者。研究對(duì)象都填寫了書(shū)面知情同意書(shū),本研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)。
1.3 方法
1.3.1OA滑膜成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定 應(yīng)用組織塊法培養(yǎng)FLS,手術(shù)中無(wú)菌條件下取下標(biāo)本,然后在無(wú)菌操作臺(tái)下用剪刀去除滑膜組織中脂肪、肌肉以及韌帶組織等。用高壓的(含雙抗)PBS沖洗幾遍組織,盡可能的將血性和脂肪顆粒沖洗干凈。用剪刀剪成1 mm×1 mm×1 mm碎片,而后用無(wú)菌巴氏管將滑膜組織均勻的貼在25 cm3的培養(yǎng)瓶中,隨后將培養(yǎng)瓶緩慢豎起,向培養(yǎng)瓶中緩慢加入約3 ml含20%FBS DMEM高糖(含雙抗)培養(yǎng)基,垂直放入含5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi),大約3~6 h后,將培養(yǎng)基緩慢翻轉(zhuǎn)放平,使培養(yǎng)基浸沒(méi)組織,避免將組織沖掉,最后再置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第2天用巴氏管將未貼壁的滑膜組織除去。根據(jù)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞狀況換液,每隔2~3 d換1次培養(yǎng)液,如果細(xì)胞內(nèi)有較多雜質(zhì)可用無(wú)菌PBS輕輕沖洗1~2遍。等細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶后進(jìn)行傳代,用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)進(jìn)行消化后傳代。經(jīng)過(guò)3~4次傳代以后,F(xiàn)LS純度達(dá)到99%左右[8]。另外,根據(jù)成纖維細(xì)胞表達(dá)VM的特性,應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)進(jìn)行定性鑒定。選取第3~4代的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。
1.3.2CCK8法檢測(cè)LF對(duì)FLS活性的影響 FLS被接種于96孔板,每孔100 μl(含約8×103個(gè)細(xì)胞)。細(xì)胞分組:調(diào)零組、空白對(duì)照組、LF處理組(LF質(zhì)量濃度為10、50、100、200、400 μg/ml)。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后,棄各孔培養(yǎng)基,向每孔加入90 μl含上述LF處理濃度的DMEM高糖培養(yǎng)基,而后再加入10 μl的CCK8溶液繼續(xù)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度,該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3.3實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理 將實(shí)驗(yàn)分為3組,分別是空白對(duì)照組、誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)加治療組。取3~4代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將消化下來(lái)的細(xì)胞懸液以每孔2×105個(gè)細(xì)胞均勻的接種于6孔板中,12~24 h后細(xì)胞基本鋪滿板底后,空白對(duì)照組不加任何藥物,誘導(dǎo)組加入IL- 1β(10 ng/ml),誘導(dǎo)加治療組加入IL- 1β(10 ng/ml)和乳鐵蛋白(100、200、400 μg/ml)。將以上各組置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,24 h后收集上述細(xì)胞和上清液。
1.3.4OA滑膜成纖維細(xì)胞蛋白和RNA的提取和檢測(cè) 收集上述處理的細(xì)胞,應(yīng)用RIPA裂解法和TRIzol法提取FLS總蛋白和總RNA。以GAPDH作為內(nèi)參,采用 Western blot和RT- PCR法檢測(cè)細(xì)胞中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白和mRNA的表達(dá)情況。
1.3.5應(yīng)用ELISA法檢測(cè)PGE2的表達(dá)情況 取3~4代細(xì)胞,以每孔約2×105個(gè)細(xì)胞均勻的接種到6孔板中,等細(xì)胞鋪滿板底80%后。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理,處理過(guò)后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,24 h后用PGE2的ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中PGE2含量。
2.1 人FLS的分離與培養(yǎng)經(jīng)組織塊法培養(yǎng)4~7 d后開(kāi)始爬出少量長(zhǎng)梭型細(xì)胞,細(xì)胞呈放射狀分布生長(zhǎng),期間混雜較多圓形的滑膜巨噬細(xì)胞。14 d后基本爬滿培養(yǎng)瓶,進(jìn)行傳代,傳到3代后視野中基本見(jiàn)不到滑膜巨噬細(xì)胞且滑膜成纖維細(xì)胞已表現(xiàn)出成纖維樣細(xì)胞的典型形態(tài),從形態(tài)上觀察基本都為成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,呈梭形,核呈橢圓形位于細(xì)胞中央,細(xì)胞狀態(tài)良好,見(jiàn)圖1。
圖1 滑膜成纖維細(xì)胞
2.2 滑膜成纖維細(xì)胞的鑒定根據(jù)成纖維細(xì)胞特異性表達(dá)VM的特性,應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光方法染色結(jié)果顯示所有細(xì)胞胞質(zhì)均呈紅色,DAPI復(fù)染后細(xì)胞核呈藍(lán)色,證明所培養(yǎng)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞,見(jiàn)圖2。
圖2 滑膜成纖維細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果
A:多聚甲醛固定的普通白光×100;B:DAPI熒光染色×400; C:Vimentin蛋白免疫熒光×400;D:B、C 組合圖×400
2.3 CCK8檢測(cè)LF對(duì)FLS活性的影響CCK8結(jié)果顯示:不同濃度的LF(10、50、100、200、400 μg/ml)對(duì)FLS活性與空白對(duì)照組比較,各組之間均無(wú)明顯差異(F=0.84,P>0.05),見(jiàn)圖3。表明在一定濃度范圍內(nèi)LF(0~400 μg/ml)不影響FLS的活性。
圖3 LF對(duì)FLS活性的影響
2.4 LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)人OA滑膜成纖維細(xì)胞MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA的影響RT- PCR結(jié)果提示,與空白對(duì)照組比較,IL- 1β誘導(dǎo)組FLS中MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA的表達(dá)有顯著差異(P<0.01),IL- 1β誘導(dǎo)組與IL- 1β+LF組(200 μg/ml)比較顯示,LF對(duì)IL- 1β導(dǎo)致的滑膜成纖維細(xì)胞中MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FMMP1=21.05,F(xiàn)MMP13=317.1,F(xiàn)COX- 2=74.59,P<0.01,見(jiàn)圖4。
圖4 MMP1、MMP13、COX- 2 mRNA在FLS中的表達(dá)
與空白對(duì)照組比較:**P<0.01;與IL- 1β誘導(dǎo)組比較:##P<0.01
2.5 LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)人OA滑膜成纖維細(xì)胞MMP1、MMP13、COX- 2蛋白水平表達(dá)的影響用WB技術(shù)測(cè)定結(jié)果提示:IL- 1β(10 ng/ml)誘導(dǎo)組與空白對(duì)照組比較,IL- 1β組中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而IL- 1β誘導(dǎo)組與IL- 1β+LF(200 μg/ml)組比較,LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)的OA滑膜成纖維細(xì)胞中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FMMP1=204.6,F(xiàn)MMP13=61.83,F(xiàn)COX- 2=653.7,P<0.01),見(jiàn)圖5。
圖5 MMP1、MMP13、COX- 2蛋白在FLS中的表達(dá)
2.6 乳鐵蛋白對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)人OA滑膜成纖維細(xì)胞PGE2表達(dá)的影響用ELISA試劑盒測(cè)量上述處理的細(xì)胞上清液結(jié)果提示:與空白對(duì)照組比較,IL- 1β誘導(dǎo)組細(xì)胞產(chǎn)生的PGE2明顯升高,而用IL- 1β+LF(200 μg/ml)組的細(xì)胞產(chǎn)生PGE2相對(duì)于只用IL- 1β明顯降低(P<0.05),各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=90.44,P<0.01)。見(jiàn)圖6。
2.7 不同劑量的LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)人OA滑膜成纖維細(xì)胞MMPs、COX- 2、PGE2表達(dá)的影響應(yīng)用Western blot和RT- PCR法分別測(cè)量按上述方法處理的細(xì)胞中的MMPs、COX- 2蛋白和mRNA表達(dá)水平,用ELISA法測(cè)量PGE2表達(dá)水平。結(jié)果提示:與空白對(duì)照組比較,IL- 1β誘導(dǎo)組中MMPs、COX- 2、PGE2的表達(dá)明顯差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與IL- 1β誘導(dǎo)組相比,在一定濃度范圍內(nèi),LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)人OA滑膜成纖維細(xì)胞MMPs、COX- 2、PGE2的表達(dá)呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.625,P<0.05)。見(jiàn)圖7。
圖6 PGE2在細(xì)胞上清液中表達(dá)情況
與空白對(duì)照組比較:**P<0.01;IL- 1β誘導(dǎo)組比較:##P<0.01
OA是最普遍的關(guān)節(jié)炎疾病,是導(dǎo)致殘疾的主要原因,其主要特征在于關(guān)節(jié)軟骨的組成、結(jié)構(gòu)和功能的顯著改變,然而OA病變不只是軟骨的病變,還有關(guān)節(jié)其他組織病變,如滑膜、脂肪墊、軟骨下骨以及半月板和韌帶等細(xì)胞和結(jié)構(gòu)的變化,其中滑膜病變對(duì)OA進(jìn)展起到重要作用[9]。在與滑膜病變相關(guān)的多種炎癥介質(zhì)中,MMP1、MMP13、COX- 2以及PGE2都對(duì)滑膜的病變起到重要作用,它們能夠促進(jìn)OA的病變。MMP- 1屬于 MMPs 中的膠原酶亞家族, 能夠降解軟骨基質(zhì)中主要組成成分Ⅱ 型膠原,同MMP1一樣,MMP13也屬于膠原酶,它又稱為膠原酶3,它能夠水解Ⅰ、Ⅱ型膠原且作用比MMP1更強(qiáng)[10]。 因此滑膜細(xì)胞中MMP1和MMP13大量產(chǎn)生對(duì)OA關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中細(xì)胞外基質(zhì)的損害增加,加速了軟骨破壞,進(jìn)而導(dǎo)致OA病變的加速。炎癥細(xì)胞因子IL- 1β能夠激活滑膜細(xì)胞中MMP- 1和MMP- 13的產(chǎn)生[4]。此外,IL- 1β也能誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞中環(huán)氧化酶的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)一氧化氮、PGE2的分泌,而PGE2的合成受COX- 2的影響。PGE2是一種多效性炎癥介質(zhì)[11],它能夠增加MMPs和其他分解代謝物質(zhì)的產(chǎn)生進(jìn)而影響關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)和功能。因此它們能夠作為OA治療的靶點(diǎn)。
圖7 LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)的FLS中MMPs、COX- 2、PGE2在基因和蛋白水平表達(dá)的影響
A:各組細(xì)胞中MMP1、MMP13、COX- 2基因表達(dá)的情況;B:各組細(xì)胞PGE2表達(dá)的情況;C:各組細(xì)胞中MMP1、MMP13、COX- 2蛋白表達(dá)的典型條帶圖;D:MMP1、MMP13、COX- 2蛋白表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)圖;1:空白對(duì)照組;2:IL- 1β誘導(dǎo)組;3、4、5:LF(100、200、400 μg/ml)+IL- 1β(10 ng/ml)組;與空白對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01;與IL- 1β誘導(dǎo)組比較:#P<0.05,##P<0.01
乳鐵蛋白作為一種多效性分子,主要存在于牛奶、唾液、眼淚、支氣管和腸分泌物以及嗜中性粒細(xì)胞顆粒中且在炎癥的情況下明顯升高[7]。目前,已經(jīng)在多種組織和細(xì)胞中研究它的抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)活性[7]。Togawa et al[12]研究發(fā)現(xiàn)LF能夠抑制結(jié)腸炎中IL- 1β的產(chǎn)生。本研究表明LF在人滑膜中的生物學(xué)效應(yīng)能夠抑制IL- 1β誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞中多種基質(zhì)降解酶以及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。OA滑膜細(xì)胞在炎癥細(xì)胞因子[如IL- 1β、腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor- alpha,TNF- α)等]作用下上調(diào)MMPs(如MMP- 1、MMP- 13)。MMPs能夠促進(jìn)關(guān)節(jié)膠原降解[13],導(dǎo)致OA軟骨的病變。本研究還表明,LF能夠?qū)θ薕A滑膜起到有效的抗炎作用。LF對(duì)OA滑膜被炎癥細(xì)胞因子刺激的抗炎能力揭示了其在預(yù)防和治療滑膜炎的潛力。在OA滑膜成纖維細(xì)胞中IL- 1β通過(guò)上調(diào)COX- 2表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生從而在OA發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[6]。PGE2能夠增加MMPs和其他分解代謝物質(zhì)的產(chǎn)生,導(dǎo)致軟骨降解、基質(zhì)合成的抑制和軟骨細(xì)胞凋亡。因此,如果能夠降低OA滑膜細(xì)胞中COX- 2和PGE2的產(chǎn)生,那么這可能改善OA的癥狀。 Rasheed et al[14]發(fā)現(xiàn)LF能夠抑制OA軟骨細(xì)胞中COX- 2和PGE2的產(chǎn)生。在OA滑膜細(xì)胞中,本研究表明LF也能夠抑制IL- 1β誘導(dǎo)OA滑膜細(xì)胞中促炎介質(zhì)COX- 2和PGE2的產(chǎn)生而且呈劑量依賴性。綜上所知,LF對(duì)IL- 1β誘導(dǎo)人OA滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)所導(dǎo)致的分解代謝和致炎作用具有明顯的抑制作用。因此,LF可能對(duì)OA具有保護(hù)作用,它可能成為預(yù)防或治療退行性關(guān)節(jié)疾病的調(diào)節(jié)分子,但是具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2019年8期