龐 欣，張建偉，韓佳瑞，王學(xué)敏，魏瀏佳

系膜增生性腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, Ms PGN)主要癥狀為不同程度的系膜基質(zhì)增多及彌漫性腎小球系膜細(xì)胞增生[1]。根據(jù)國內(nèi)大量臨床病理資料表明，Ms PGN是我國常見的原發(fā)性腎小球疾病[2]。丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)作為丹參最主要提取成分和活性成分,是一種水溶性化合物(分子式為C36H30O16，相對分子質(zhì)量：718.62)[3]。SAB具有減輕局部缺血損傷的功效[4]和抗凋亡作用，SAB在大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中通過降低細(xì)胞外Ca2+濃度和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 3(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase- 3)活性，能提高線粒體能量代謝和抗氧化能力從而保護(hù)細(xì)胞不被凋亡[5]。在Ms PGN中涉及細(xì)胞炎癥和凋亡的通路眾多，但臨床上有關(guān)SAB的治療及作用機(jī)制還是極少報道。該研究探討SAB對大鼠Ms PGN模型的治療效果和作用機(jī)制，期望為Ms PGN的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑Click- iT? Plus 缺口末端標(biāo)記(TdT- mediated dUTP Nick- End Labeling, TUNEL)試劑盒(貨號：C10618)購自美國Invitrogen公司。蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：C0105)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Caspase- 3(貨號：ab13847)、Bcl- 2相關(guān)的X蛋白(Bcl- 2- associated X protein，Bax)(貨號：ab53154)、B淋巴細(xì)胞瘤- 2(B- cell lymphoma- 2，Bcl- 2)(貨號：ab692)、核因子κB p65(nuclear factor kappa- B p65，NF- κB p65)(貨號：8242)、甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH)(貨號：1056)、腫瘤壞因子- α(tumor necrosis factor- α，TNF- α)(貨號：11948)一抗購自美國abcam公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。白細(xì)胞介素- 1β(interleukin- 1β，IL- 1β)(E- EL- M0037c)、IL- 6(貨號：E- EL- R0015c)和IL- 18(貨號：E- EL- R0015c)等ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特(Elabscience)生物科技股份有限公司。

1.2 儀器PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀均購自美國伯樂公司。Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司。Multiskan GO酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1改良慢性血清病法復(fù)制Ms PGN大鼠腎功能損傷模型及藥物治療方式 選擇40只3周齡SPF級別SD大鼠，體質(zhì)量(250±50)g，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SYXK(京)2014- 0001，合格證號：0015675。大鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度26～28 ℃，濕度50%～60%，光照時間12 h，自由采食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為四組，分別設(shè)置健康對照組(control, Ctrl)組、SAB單獨作用組(SAB組)、Ms PGN(100 mg/kg)組和Ms PGN+SAB (100 mg/kg)組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，自正式實驗第1天起經(jīng)口灌服牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)400 mg/kg(4 ml/kg) 隔日1次，用蒸餾水配制BSA，灌胃直至第8周；于實驗第1天經(jīng)皮下分點注射完全弗氏佐劑0.2 ml(含BSA 2 mg)，第8天經(jīng)皮下分點注射不完全弗氏佐劑0.2 ml(含BSA 2 mg)。于實驗第8天和第15天，分別從尾靜脈注射BSA 0.4 mg/kg體質(zhì)量(配成無菌生理鹽水溶液)各1次。建立Ms PGN大鼠模型。

1.3.2大鼠基本指標(biāo)檢測 SAB治療結(jié)束后樣本提取前，稱量大鼠體質(zhì)量，并檢測尿蛋白、血清肌酐和尿氮含量。SAB治療結(jié)束后樣本提取前，稱量大鼠體質(zhì)量，并檢測尿蛋白、血清肌酐和尿氮含量。

1.3.3HE染色 腎臟組織經(jīng)福爾馬林固定后，修剪脫水透明后進(jìn)行石蠟包埋。切片后逐步經(jīng)HE染色，脫水透明后封片觀察。

1.3.4ELISA檢測炎癥因子 大鼠心臟取血1 ml，低溫離心機(jī)4 000 r/min離心8 min，取出上清液供實驗使用。具體檢測步驟按照Elabscience公司提供的使用說明書進(jìn)行。

1.3.5TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 具體制片同HE步驟，后期染色參照Invitrogen公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3.6免疫組織化學(xué)法分析組織中抗原表達(dá) 取出腎臟組織后用PBS清洗8次，去掉壞死組織及血凝塊。用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%和70%酒精依次清洗。脫水，石蠟包埋。1% Triton- 100處理15 min，3% H2O2處理15 min。5%羊血清封閉30 min后依次孵育一抗和二抗。染色封片。

1.3.7Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 收集四組組織細(xì)胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。具體Western blot步驟按照abcam公司提供產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 SAB改善Ms PGN大鼠腎功能指標(biāo)SAB治療大鼠Ms PGN模型后，各組之間體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與Ctrl組比較，SAB組大鼠尿蛋白(2.36±0.20) mg/24 h、血清肌酐(0.54±0.02) mg/dl和尿氮含量(16.20±2.60) mg/dl間無明顯差異；Ms PGN組與SAB組比較，尿蛋白(38.20±6.02) mg/24 h、血清肌酐(1.10±0.16) mg/dl和尿氮指標(biāo)(22.64±2.26) mg/dl均顯著上升(F=376.01，P<0.001；F=183.19，P<0.001，F(xiàn)=83.57，P<0.001)；與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組尿蛋白(18.26±2.62) mg/24 h、血清肌酐(0.68±0.08) mg/dl和尿氮指標(biāo)(17.98±2.06) mg/dl均明顯下調(diào)(P<0.05)。見圖1。

2.2 SAB抑制Ms PGN腎小球細(xì)胞凋亡HE染色實驗顯示：與Ctrl組比較，SAB組大鼠腎小球細(xì)胞無系膜基質(zhì)與系膜細(xì)胞增生，腎間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤，提示SAB使用對大鼠體征沒有明顯的影響。與Ctrl組比較，Ms PGN組大鼠腎小球細(xì)胞間具有大量的系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞增生，腎間質(zhì)充滿炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞空泡化及顆粒樣化，提示造模成功；與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組大鼠腎小球細(xì)胞系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞增生明顯減少，炎癥浸潤細(xì)胞減少，病理損害較小。TUNEL染色實驗顯示：與Ctrl組比較，SAB組大鼠腎小球細(xì)胞沒有明顯凋亡現(xiàn)象；與Ctrl組比較，Ms PGN組大鼠腎小球細(xì)胞發(fā)生十分顯著的凋亡現(xiàn)象(F=747.56，P<0.01)；與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡現(xiàn)象得到明顯緩解(t=79.436，P<0.05)，見圖2。

2.3 SAB降低腎小球細(xì)胞促凋亡因子表達(dá)免疫組化實驗顯示：SAB組與Ctrl組比較，腎小球組織中Caspase- 3表達(dá)水平無差異；Ms PGN組與SAB組比較，Caspase- 3表達(dá)水平顯著上升(F=3718.79，P<0.01)；與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組Caspase- 3表水平明顯下調(diào)(F=10.254，P<0.05)。Western blot實驗結(jié)果顯示：SAB組與Ctrl組比較，腎小球組織中促凋亡因子Bax、凋亡抑制因子Bcl- 2及Bax/ Bcl- 2水平均無顯著差異。Ms PGN組與SAB組比較，Bcl- 2明顯下調(diào)，Bax及Bax/Bcl- 2顯著上升(F=534.52，P<0.05)；與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組Bcl- 2表達(dá)升高，Bax及Bax/Bcl- 2顯著下降(F=8.37，P<0.05)。見圖3。

圖1 不同處理組大鼠基本指標(biāo)測量

圖2 HE/TUNEL染色鑒定腎小球細(xì)胞形態(tài)及凋亡水平×400
與Ctrl組比較：**P<0.01；與Ms PGN組比較：#P<0.05

圖3 免疫組化及Western blot檢測腎小球組織中凋亡相關(guān)因子表達(dá)水平(上排圖為免疫組化染色 ×400)1：Ctrl組；2：SAB組；3：Ms PGN組；4：Ms PGN+SAB組;與Ctrl組比較：**P<0.01；與Ms PGN組比較：#P<0.05；與Ms PGN組比較：##P<0.01

圖4 ELISA法檢測血清中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平

2.4 SAB降低血清中炎癥因子表達(dá)ELISA檢測血清中相關(guān)炎癥因子IL- 1β、IL- 6和IL- 18結(jié)果顯示：SAB組與Ctrl組比較，腎小球組織中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平無差異；Ms PGN組與SAB組比較，各炎癥因子表達(dá)水平顯著上升(F=300.65，P<0.05；F=377.28，P<0.05；F=178.20，P<0.05)；與而相較于Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組各炎癥因子表達(dá)水平下調(diào)(F=155.15，P<0.05；F=59.00，P<0.05；F=39.27，P<0.05)。見圖4。

2.5 SAB降低腎小球組織凋亡誘導(dǎo)通路分子活性Western blot檢測腎小球組織中NF- κB p65和TNF- α結(jié)果顯示：SAB組與Ctrl組比較，NF- κB p65和TNF- α表達(dá)水平無差異；Ms PGN組與SAB組比較，NF- κB p65和TNF- α表達(dá)水平顯著上升(F=77.54，P<0.05；F=308.48，P<0.05)；Ms PGN+SAB組NF- κB p65和TNF- α表達(dá)水平明顯下調(diào)(F=14.81，P<0.05；F=28.69，P<0.05)。見圖5。

3 討論

Ms PGN的主要特點是腎小球細(xì)胞的過度增生和細(xì)胞外基質(zhì)降解。腎小球細(xì)胞過度增生是腎小球硬化造成腎損傷最關(guān)鍵進(jìn)程[6]。目前西醫(yī)治療Ms PGN的手段主要是激素、免疫抑制劑等，但至今仍然沒有闡述清楚哪種藥物更有效，且這些藥物尚有自身毒副作用[7]。近年來，Ms PGN中醫(yī)辨證論治用藥取得了較好的臨床療效[8]。而SAB作為中藥丹參最主要提取成分和活性成分，對心、腦、肝等器官均具有重要藥理作用，但SAB對Ms PGN腎臟的作用并不清楚。本研究HE染色實驗顯示：與Ctrl組比較，SAB組大鼠腎小球細(xì)胞無系膜基質(zhì)與系膜細(xì)胞增生，腎間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤，提示SAB使用對大鼠體征沒有明顯的影響。與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組大鼠腎小球細(xì)胞系膜基質(zhì)和系膜細(xì)胞增生明顯減少，炎癥浸潤細(xì)胞減少，病理損害較小。TUNEL染色實驗顯示：與Ctrl組比較，Ms PGN組大鼠腎小球細(xì)胞發(fā)生十分顯著的凋亡現(xiàn)象(F=747.56，P<0.01)，見圖2；與Ms PGN組比較，Ms PGN+SAB組大鼠腎小球細(xì)胞凋亡現(xiàn)象得到明顯緩解(t=79.436，P<0.05)，見圖2。

圖5 Western blot檢測各組腎小球組織中相關(guān)凋亡基因表達(dá)水平

1：Ctrl組；2：SAB組；3：Ms PGN組；4：Ms PGN+SAB組;與Ctrl組比較：*P<0.05；與Ms PGN組比較：#P<0.05

有文獻(xiàn)[5,9]報道SAB可以通過降低細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣濃度來降低Caspase- 3活性，來減少皮層神經(jīng)元和肝細(xì)胞等的細(xì)胞凋亡。Tang et al[10]證明在大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中，SAB可以抑制由淀粉狀蛋白β肽引起的細(xì)胞凋亡。但是SAB對于Ms PGN的研究鮮有報道，在Ms PGN病理發(fā)生過程中，腎小球組織細(xì)胞中往往會伴隨著嚴(yán)重凋亡現(xiàn)象，因此腎小球抗凋亡治療將是臨床研究關(guān)鍵節(jié)點。本研究結(jié)果不僅從TUNEL水平上證明了SAB治療后腎小球細(xì)胞凋亡減少，同時Caspase- 3、Bax、Bax/Bcl- 2也發(fā)生顯著下調(diào)；證實SAB可以有效降低腎小球細(xì)胞發(fā)生凋亡，預(yù)示著Ms PGN作用于大鼠之后可以有效抑制Ms PGN疾病大鼠腎小球細(xì)胞凋亡發(fā)生。

本研究同時檢測到大鼠血清中炎癥因子IL- 1β、IL- 6和IL- 8也發(fā)生了明顯下調(diào)。表明SAB對于抑制體內(nèi)炎癥也發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子NF- κB在炎癥和免疫應(yīng)答、抗凋亡過程中具有重要作用[11]。p65是NF- κB的亞單位，并且是多種激酶磷酸化激活靶點，p65磷酸化過程在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮著作用，如可以激活TNF- α來響應(yīng)免疫應(yīng)答。而另一方面TNF- α不但自身可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可以激活p65來響應(yīng)下游炎癥因子應(yīng)答[12-13]。綜合前人和本實驗結(jié)果可以推測，在SAB對Ms PGN的治療過程中，SAB既可抑制NF- κB- p65和TNF- α活性來降低炎癥因子，還可以抑制Caspase- 3依賴的凋亡通路來抑制凋亡發(fā)生，從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

綜上所述，本文首次通過實驗證實SAB對Ms PGN有一定保護(hù)作用，通過降低NF- κB- p65/Bax和TNF- α活性，并抑制Caspase- 3依賴的細(xì)胞凋亡及降低細(xì)胞炎癥因子釋放來實現(xiàn)。本研究通過Ms PGN 損傷大鼠模型初步探究了SAB在大鼠治療Ms PGN損傷方面具有相關(guān)性和可行性。但是SAB在體內(nèi)發(fā)揮功能的信號通路比較復(fù)雜，需要進(jìn)一步明確其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制并選擇關(guān)鍵靶點分子才能為精準(zhǔn)治療系膜增生性腎炎提供指導(dǎo)。后續(xù)應(yīng)該從SAB在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)等方面來進(jìn)一步闡述SAB的作用效果；同時還應(yīng)該針對不同物種進(jìn)行相應(yīng)的研究，以便更加清楚地探究SAB的作用機(jī)制。