江 勇，錢葉本，陳 朋，朱 良

肝細(xì)胞性肝癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 是原發(fā)性肝癌的主要類型，肝癌發(fā)病率居全球腫瘤的第5位，然而僅我國肝癌年發(fā)病例數(shù)就達(dá)到全世界的55%，且新發(fā)病例數(shù)仍在逐年增加[1]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是困擾肝癌患者治療和預(yù)后的主要難點。因此，深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)機(jī)制，積極探討其差異表達(dá)的基因和通路，有助于進(jìn)一步認(rèn)識肝癌的發(fā)病機(jī)制，提升肝癌的治療水平和改善患者的預(yù)后。

基因芯片具有高通量、高靈敏度和自動快速等優(yōu)點，可平行對比腫瘤組織及其對應(yīng)的正常組織的基因表達(dá)水平，極大地提高了差異表達(dá)基因的篩選效率[2]，有利于深入認(rèn)識腫瘤的發(fā)病機(jī)制，提升肝癌患者早期診斷、治療和預(yù)后的水平。該研究通過分析肝癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織的基因芯片，篩選得到差異表達(dá)基因；進(jìn)一步通過生物信息學(xué)的方法，對篩選得到的差異基因進(jìn)行聚類和功能富集分析，同時構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到核心基因。最后通過TCGA數(shù)據(jù)庫中的肝癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)RNA- sequencing初步探究核心基因的表達(dá)水平，為肝癌的診斷和治療提供潛在的生物標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 病例資料根據(jù)醫(yī)學(xué)倫理要求和組織樣本取材標(biāo)準(zhǔn)，2對肝癌組織及其對應(yīng)的癌旁正常肝臟組織來自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科，組織標(biāo)本取材于肝癌根治性切除術(shù)后組織。經(jīng)過病理診斷后，確診為肝細(xì)胞性肝癌?；颊咝g(shù)前未進(jìn)行過放療、化療或者介入治療等操作。組織樣本放入液氮中保存。該研究已經(jīng)得到安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批文號：2018- 13- 22)。

1.2 基因芯片本研究使用的基因芯片為Agilent Human Gene Expression(4×44 k)，包括41 000條探針，由伯豪生物技術(shù)公司提供，實際操作流程參照Agilent表達(dá)譜芯片標(biāo)準(zhǔn)流程：總RNA反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，再進(jìn)一步用Cyanine- 3- CTP (Cy3)標(biāo)記得到cRNA。將標(biāo)記好的cRNA和芯片雜交，洗脫結(jié)束后，利用Agilent Scanner G2505C (Agilent Technologies) 掃描得到原始圖像。

1.3 方法

1.3.1組織樣本RNA提取和純化 肝癌及其癌旁組織的總RNA通過QIAGEN RNeasy?Mini Kit(貨號：#74106)試劑盒提取和純化，同時純化得到的RNA通過NanoDrop ND- 2000 (Thermo Scientific)進(jìn)行定量檢測，RNA完整性經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) 檢測。

1.3.2芯片雜交與掃描 總RNA通過反轉(zhuǎn)錄得到雙鏈cDNA，再進(jìn)一步用Cyanine- 3- CTP (Cy3) 熒光染料標(biāo)記雙鏈cDNA，得到cRNA。經(jīng)QIAGEN RNeasy? Mini Kit試劑盒純化后，將標(biāo)記好的cRNA置于60 ℃溫水浴30 min，隨后冰水浴1 min，進(jìn)行片段化處理。隨后將芯片與cRNA在65 ℃、10 r/min的條件下，于雜交爐中滾動雜交17 h。雜交結(jié)束后，進(jìn)行芯片洗脫。最后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)掃描得到原始圖像，通過Feature Extraction軟件(version10.7.1.1, Agilent Technologies)處理原始圖像，得到原始數(shù)據(jù)。

1.3.3芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理和差異基因分析 利用Genespring軟件(version 12.5; Agilent Technologies)對芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，在用于比較的每組樣本中，至少有1組完全標(biāo)記為已被檢測出的探針，進(jìn)行后續(xù)分析。利用基因表達(dá)倍數(shù)變化值(Fold change)進(jìn)行差異基因篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)：Fold change的絕對值≥3.0。

1.3.4GO功能注釋和KEGG富集分析 使用DAVID(version 6.7, http://david.abcc.ncifcrf.gov/)在線分析平臺[3]，對篩選得到的差異基因在基因本體(gene ontology, GO)中注釋，并進(jìn)行KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)功能富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能和通路。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3.5蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和篩選核心蛋白 通過String蛋白互作數(shù)據(jù)庫(the Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes, STRING, http://string- db.org/)分析差異表達(dá)基因的蛋白互作關(guān)系[4]，并以此來構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置閾值條件為綜合相關(guān)性評分>0.4。將String蛋白互作數(shù)據(jù)庫分析得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，通過網(wǎng)絡(luò)分析插件CytoHubba計算節(jié)點的邊(Degree，即互作連線的數(shù)量)，篩選得到網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點 (Hub Node)。中心節(jié)點對應(yīng)的基因即為核心基因，同時也稱作核心蛋白。

1.3.6核心基因的表達(dá)驗證 肝癌原始的基因表達(dá)數(shù)據(jù)RNA- sequencing下載于TCGA數(shù)據(jù)庫，通過Perl處理下載的原始數(shù)據(jù)，生成基因矩陣。再將Ensembl Gene ID轉(zhuǎn)換為基因名稱 (Gene symbol)，得到最終可分析的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，包括374例肝癌組織和50例正常肝臟組織，初步探究核心基因在肝癌組織中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因差異表達(dá)基因以Fold change≥3.0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在肝癌及癌旁組織中共篩選出4 324 個差異基因，其中上調(diào)表達(dá)的有2 552個基因，下調(diào)表達(dá)的有1 772個基因。挑選差異程度最大的前100個基因，熱圖用于展示這些基因在肝癌組織和正常組織的表達(dá)情況，見圖1，紅色代表高表達(dá)；綠色代表低表達(dá)。本研究的基因芯片結(jié)果已上傳到gene expression omnibus (GEO) 數(shù)據(jù)庫中(編號：GSE117361)。

圖1 前100個差異表達(dá)基因的熱圖

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能注釋GO功能注釋的結(jié)果表明，差異表達(dá)基因在分子功能、生物過程及細(xì)胞組成的分布是存在差異的。根據(jù)顯著富集GO結(jié)果，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在血小板衍生生長因子結(jié)合、受體抑制劑和拮抗劑活性等相關(guān)的分子功能，同時也富集于調(diào)節(jié)細(xì)胞對血管內(nèi)皮生長因子反應(yīng)等生物過程和膠原蛋白復(fù)合物等細(xì)胞組成，見圖2。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析差異基因的KEGG信號通路富集分析結(jié)果表明，在顯著富集KEGG的結(jié)果中，包括TGF- β信號通路、Rap1信號通路、PI3K- Akt信號通路、細(xì)胞黏附、ECM- 受體相互作用以及趨化因子信號通路等，與肝癌發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)，這進(jìn)一步說明在肝癌的發(fā)病過程中多條信號通路失控，可能在疾病進(jìn)展中起到十分重要的作用，見圖3。

圖2 GO功能注釋

2.4 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析通過String蛋白互作數(shù)據(jù)庫分析處理差異基因，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4。根據(jù)節(jié)點數(shù)目排序得到最相關(guān)的6個核心蛋白，對應(yīng)的基因分別為DCN、TNF、COL1A1、COL3A1、FN1和COL1A2。

2.5 核心基因的表達(dá)驗證通過TCGA數(shù)據(jù)庫中374例肝癌組織和50例正常肝臟組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，初步探究6個核心基因DCN、TNF、COL1A1、COL3A1、FN1和COL1A2的表達(dá)情況，見圖5。結(jié)果表明，COL1A1(P<0.000 1)和COL1A2(P<0.000 1)在肝癌組織中的表達(dá)較正常組織顯著上調(diào)，DCN在肝癌組織中的表達(dá)較正常組織顯著下調(diào)(P<0.000 1)；而TNF(P=0.052 2)，F(xiàn)N1(P=0.103 0)和COL3A1(P=0.767 5)的表達(dá)無明顯差異。

3 討論

中國是肝癌發(fā)病率最高的國家，與乙肝病毒感染密切相關(guān)，其具體的發(fā)病機(jī)制不明。肝癌患者的確診往往都在晚期，失去了根治性手術(shù)治療的機(jī)會，且肝癌術(shù)后易復(fù)發(fā)，極大地影響了患者的預(yù)后。基因芯片技術(shù)可探索腫瘤發(fā)病過程中多種基因的表達(dá)變化及相互之間的調(diào)控關(guān)系，這有利于理解肝癌的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步提高診治水平，改善預(yù)后。

本研究收集了新鮮的肝癌及癌旁組織，深入分析其基因芯片的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了4 324個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的有2 552個基因，下調(diào)表達(dá)的有1 772個基因。這一結(jié)果說明了肝癌發(fā)病過程中的基因轉(zhuǎn)錄變化，其發(fā)病機(jī)制可能與特定基因和表觀遺傳的變化密切相關(guān)。通過GO功能注釋和KEGG富集分析差異表達(dá)基因潛在的生物學(xué)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集于血小板衍生生長因子結(jié)合等分子功能，血管內(nèi)皮生長因子反應(yīng)等生物過程和膠原蛋白復(fù)合物等細(xì)胞組成；KEGG富集信號通路顯示，差異表達(dá)基因主要參與了TGF- β、Rap1、PI3K- Akt和細(xì)胞黏附等信號通路，這些信號通路的變化與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TGF- β信號通路參與了肝癌發(fā)生發(fā)展的每個階段，其在肝纖維化的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用；同時TGF- β在肝癌中表達(dá)上調(diào)，與肝癌預(yù)后直接相關(guān)[5]。Rap1是Ras家族單體G蛋白的成員之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，已經(jīng)得到大家的共識[6]。 研究[7]表明Rap1可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞黏附、遷移和侵襲能力；在不同腫瘤類型中，Rap1信號通路的激活呈現(xiàn)出截然不同的表現(xiàn)，尤其是影響腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，依然有待于進(jìn)一步研究。Rap1的激活對于EGFR介導(dǎo)胰腺癌的轉(zhuǎn)移過程中是必不可少的，同時腫瘤的生長不受影響[8]。PI3K- Akt主要通過酪氨酸激酶受體傳遞生長因子的信號被激活[9]，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，與肝癌的發(fā)病過程密切相關(guān)[10]。由此說明，差異表達(dá)基因參與了肝癌發(fā)病過程中的多種細(xì)胞生物學(xué)過程，有待進(jìn)一步研究其具體的生物學(xué)機(jī)制。

圖3 KEGG 通路富集分析

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，本研究得到了可能與肝癌發(fā)生密切相關(guān)的6個核心蛋白，對應(yīng)的基因分別為DCN、TNF、COL1A1、COL3A1、FN1和COL1A2。進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果表明DCN、COL1A1和COL1A2在肝癌組織中的表達(dá)存在顯著差異(P<0.000 1)，而TNF、FN1和COL3A1的表達(dá)無明顯差異。核心蛋白聚糖 (decorin, DCN) 是存在于細(xì)胞外基質(zhì)的一類富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖，研究表明DCN可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，可與多種細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤抑制的作用，包括對自噬和炎癥的刺激作用以及對血管生成和腫瘤發(fā)生的抑制作用。肝硬化是肝癌重要的癌前病變，研究發(fā)現(xiàn)DCN在肝硬化組織的表達(dá)顯著高于肝癌及癌旁組織，而DCN在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織；同時，DCN高表達(dá)的肝癌患者中位生存期更長，提示DCN可作為肝癌的預(yù)后標(biāo)志物[11]。DCN可調(diào)控膠原纖維的生成，特異性地阻斷TGF- β信號通路，發(fā)揮抗纖維化的生物活性[12]。COL1A1和COL1A2基因分別編碼I型膠原蛋白的pro- α1鏈和pro- α2鏈，該膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)包括兩條α1鏈和一條α2鏈，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白。COL1A1在侵襲性肝癌中表達(dá)上調(diào)，此外，COL1A1和COL1A2基因促進(jìn)了I型膠原蛋白的合成，有助于HCC的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。COL1A1的啟動子發(fā)生甲基化，導(dǎo)致其在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，該表觀遺傳改變可能作為HCC的預(yù)后標(biāo)志物[14]。微小RNA(MicroRNA)let- 7g 可抑制肝癌的轉(zhuǎn)移，研究發(fā)現(xiàn)其抑制作用部分是通過靶向作用于COL1A2實現(xiàn)的[15]。

圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 TCGA數(shù)據(jù)庫初步驗證核心基因的表達(dá)

A：DCN；B：TNF；C：COL1A1；D：FN1；E：COL3A1；F：COL1A2；與正常組織比較：****P<0.000 1

綜上所述，肝癌發(fā)病過程中涉及多基因、多通路的改變，本研究通過基因芯片篩選肝癌的差異表達(dá)基因和通路，有助于進(jìn)一步理解肝癌的發(fā)病機(jī)制。同時，通過TCGA數(shù)據(jù)庫初步驗證了核心基因的表達(dá)，為肝癌提供了新的研究方向，有待于進(jìn)一步研究其具體的功能和作用。