龐 昶，林樹無

肺癌發(fā)病率逐年上升，已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率以及病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占了80%～90%[1]。隨著近年來靶向治療的進(jìn)展，吉非替尼療效明顯優(yōu)于常規(guī)化療[2]，但仍有發(fā)生嚴(yán)重的藥物相關(guān)性肺纖維化的風(fēng)險(xiǎn)。肺纖維化進(jìn)行性加重，呼吸困難是其最常見和最突出的臨床癥狀，其5年生存率為30%～50%[3]。

目前，第一種法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR) 靶向藥物奧貝膽酸(obeticholicacid，OCA)已被宣稱有效治療肝纖維化[4]。轉(zhuǎn)化生長因子- β1(transforming growth factor- β1，TGF- β1)是肺纖維化形成的關(guān)鍵因子[5]。α- 平滑肌肌動(dòng)蛋白(α- smooth muscle actin，α- SMA)參與了肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及心肌纖維化的發(fā)生[6]。Smad 蛋白家族的Smad2/3、Smad7是TGF- β1特異的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[7]。奧貝膽酸減少肝臟纖維化與降低α- SMA、TGF- β1蛋白等纖維化指標(biāo)密切相關(guān)[8]，就是說奧貝膽酸可以下調(diào)α- SMA、TGF- β1等肺纖維化指標(biāo)，或許是奧貝膽酸可能治療肺間質(zhì)纖維化的一個(gè)機(jī)制。該研究應(yīng)用細(xì)胞組和動(dòng)物組實(shí)驗(yàn)檢測TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白的表達(dá)水平，初步探討奧貝膽酸抑制肺纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞組實(shí)驗(yàn)材料人肺成纖維細(xì)胞HFL1細(xì)胞(上海滬震生物科技有限公司)； 1640培養(yǎng)基(美國HyClone生物技術(shù)公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus顯微鏡公司)；高壓滅菌鍋(日本三洋公司MLS- 3750)；無菌操作臺(tái)(SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；吉非替尼(生產(chǎn)批號(hào)：H20090759，英國Tocris Bioscie公司，200 mg/kg灌胃)；奧貝膽酸(連云港騰發(fā)生物科技有限公司，美國Intercept公司生物制藥有限公司生產(chǎn)，5 mg/kg 灌胃)；博來霉素(生產(chǎn)批號(hào)：H20051232，上海偉進(jìn)生物科技有限公司，5 mg/kg向氣管內(nèi)注入建模)；小型高速離心機(jī)(德國Eppendorf AG 22331 Hamburg)；TGF- β1 ELISA試劑盒、α- SMA ELISA試劑盒、Smad2/3 ELISA試劑盒、Smad7 ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)；兔抗鼠Smad2/3一抗、兔抗鼠Smad7一抗、兔抗鼠TGF- β1一抗、兔抗鼠α- SMA一抗、兔抗鼠β- actin一抗、羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology生物公司)。共設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組[9]：對(duì)照組、吉非替尼組、奧貝膽酸+吉非替尼組。將吉非替尼2.5 μmol/L, 奧貝膽酸5 mg/L各3 ml分組與HFL1細(xì)胞共培養(yǎng)6 d，采用ELISA方法對(duì)TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量進(jìn)行檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康清潔級(jí)SD雄性大鼠 60只，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(京)- 2017-0011。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，相對(duì)濕度(50±5)%。采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組[9]：對(duì)照組、博來霉素組、吉非替尼+博來霉素、吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組。

1.3 模型制備及給藥對(duì)照組向氣管內(nèi)注入蒸餾水50 μl，余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均向氣管內(nèi)注入以蒸餾水稀釋的博來霉素(5 mg/kg)溶液50 μl建立肺纖維化模型。注射后迅速沿縱軸旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)均勻分布。博來霉素+吉非替尼組2 h后給予吉非替尼200 mg/kg、2 ml灌胃。吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組2 h后給予吉非替尼200 mg/kg、2 ml灌胃，4 h后給予奧貝膽酸5 mg/kg、2 ml灌胃治療。

1.4 動(dòng)物組實(shí)驗(yàn)TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)的測定實(shí)驗(yàn)日期以動(dòng)物灌胃造模試驗(yàn)當(dāng)天為實(shí)驗(yàn)0 d，實(shí)驗(yàn)第1、3、7、14、21天4組每組分別處死3只大鼠，采用ELISA方法對(duì)第1、3、7、14、21 d大鼠血漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。采用Western blot方法檢測21 d大鼠肺組織勻漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表達(dá)情況。

1.5 肺組織病理學(xué)評(píng)價(jià)選擇實(shí)驗(yàn)第1、3、7、14、21天各組大鼠肺組織剪取部分肺葉，做成切片進(jìn)行HE染色，在100倍光鏡下觀察肺組織形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞組實(shí)驗(yàn)奧貝膽酸對(duì)各組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影響與對(duì)照組比較，吉非替尼組及奧貝膽酸+吉非替尼組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達(dá)均有所增加，Smad7蛋白的表達(dá)逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。奧貝膽酸+吉非替尼組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達(dá)各時(shí)點(diǎn)均明顯低于吉非替尼組，但仍高于對(duì)照組，Smad7蛋白的表達(dá)顯著高于吉非替尼組，但仍低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 細(xì)胞組實(shí)驗(yàn)各組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量測定

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與吉非替尼組比較：##P<0.01

2.2 動(dòng)物組奧貝膽酸對(duì)各組大鼠血漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影響動(dòng)物組實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組比較，博來霉素組、吉非替尼+博來霉素組、吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組均隨著時(shí)間延長，TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達(dá)逐漸升高，各時(shí)點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組，Smad7蛋白的表達(dá)逐漸下降，各時(shí)點(diǎn)均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。吉非替尼+博來霉素+奧貝膽酸組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達(dá)各時(shí)點(diǎn)均明顯低于博來霉素組及吉非替尼+博來霉素組，但仍高于對(duì)照組，Smad7蛋白的表達(dá)顯著高于博來霉素組及吉非替尼+博來霉素組，但仍低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.3 動(dòng)物組奧貝膽酸對(duì)各組大鼠肺組織勻漿中第21天TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影響與對(duì)照組比較，博來霉素組、博來霉素+吉非替尼組及博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表達(dá)均有所增加，Smad7均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表達(dá)低于博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組，但仍高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組21 d Smad7蛋白表達(dá)明顯高于博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組，但仍低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

表1 各組大鼠血漿中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量比較

與對(duì)照組比較：**P<0.01；與博來霉素組比較：##P<0.01；與吉非替尼+博來霉素組比較：▽▽P<0.01

2.4 奧貝膽酸對(duì)各組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響肺組織病理切片HE染色結(jié)果示對(duì)照組結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯形態(tài)改變、炎癥浸潤和纖維化。與對(duì)照組大鼠肺組織相比，博來霉素+吉非替尼組大鼠肺水腫，明顯的纖維組織增生。博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組早期(1～7 d)病理特征為肺充血、肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤。博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組14 d后，肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，纖維結(jié)締組織增多，肺泡壁逐漸增厚。博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組21 d后，膠原沉積，肺組織彌漫性肺纖維化。與博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組大鼠肺組織相比，博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組病理學(xué)改變有顯著改善，肺組織纖維化程度顯著減輕。見圖 3。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌中較常見的類型，由于早期無典型癥狀，故多數(shù)患者就診時(shí)已為晚期，錯(cuò)失手術(shù)最佳時(shí)機(jī)，而化療成為了晚期非小細(xì)胞肺癌首選的治療方式[10]。吉非替尼是一種分子靶向藥物，可抑制腫瘤生長，全球因吉非替尼所致的間質(zhì)性肺炎平均發(fā)病率約1%[11]。現(xiàn)有的治療方法不能有效地緩解病情的發(fā)展和使肺纖維化逆轉(zhuǎn)，迫切需要新的治療藥物減緩肺纖維化進(jìn)展。

圖2 動(dòng)物組中各組21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白的表達(dá)水平

A：對(duì)照組；B：博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組；C：博來霉素組；D：博來霉素+吉非替尼組；與對(duì)照組比較：**P<0.01；與博來霉素組比較：##P<0.01；與吉非替尼+博來霉素組比較：▽▽P<0.01

圖3 各組各時(shí)間段大鼠肺組織病理變化HE ×100

A：對(duì)照組；B：博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組；C：博來霉素組；D：博來霉素+吉非替尼組

在纖維化進(jìn)程中，會(huì)受到TGF- β1與下游Smad 蛋白家族信號(hào)通路的調(diào)控[12]。Smad3 促進(jìn)纖維化的形成，Smad7 卻是TGF- β1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要抑制性蛋白[13]。已經(jīng)有多個(gè)研究[14]證實(shí)單純用吉非替尼灌胃小鼠不能引起肺組織明顯的纖維化改變。博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型目前已較成熟，故使用博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化后，予吉非替尼及奧貝膽酸進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)纖維化效果的影響，是一種高效、切實(shí)可行的辦法。本研究選擇TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7作為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明，博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表達(dá)均有所增加，Smad7蛋白表達(dá)均有所下降，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，肺纖維化程度加重。博來霉素+吉非替尼+奧貝膽酸組與博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組比較TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表達(dá)均降低，Smad7蛋白的表達(dá)均升高，可見奧貝膽酸可以拮抗吉非替尼，達(dá)到降低肺纖維化的程度。本實(shí)驗(yàn)中肺組織病理學(xué)鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，博來霉素組及博來霉素+吉非替尼組肺泡內(nèi)可見大量膠原片狀，絮狀沉積，纖維灶融合。而奧貝膽酸治療組可見肺泡內(nèi)膠原沉積顯著減少，肺泡破壞減輕，無明顯纖維灶融合。可見奧貝膽酸可以抑制吉非替尼誘導(dǎo)的肺纖維化病理過程。綜上可見，加入奧貝膽酸干預(yù)后TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白含量表達(dá)均降低，Smad7蛋白表達(dá)均升高，同時(shí)大鼠肺組織病理纖維化程度降低，證實(shí)奧貝膽酸可以通過干預(yù)TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7信號(hào)對(duì)吉非替尼導(dǎo)致的肺纖維化產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)僅為初步研究，后續(xù)還可以通過研究溶血磷脂酸(LPA)、丙二醛(MDA) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、過氧化氫酶(CAT)、還原性谷胱甘肽(GSH) 、Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白等肺纖維化相關(guān)指標(biāo)，以進(jìn)一步求證奧貝膽酸對(duì)吉非替尼誘導(dǎo)的肺纖維化的作用。

吉非替尼近年來廣泛用于局部晚期與轉(zhuǎn)移性NSCLC的治療。肺間質(zhì)纖維化是吉非替尼治療過程中少見但致命的不良反應(yīng)。在既往的研究中，顯示吉非替尼抗腫瘤同時(shí)具有抑制氣管上皮細(xì)胞表皮生長因子受體的表達(dá)功能，影響其受損后的修復(fù)，導(dǎo)致免疫反應(yīng)失控，產(chǎn)生間質(zhì)性肺炎[15]。尋找合適的抗肺纖維化藥物和阻止肺纖維化疾病的策略，己經(jīng)持續(xù)了好幾十年，但是理想的治療手段還沒有找到。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)奧貝膽酸能夠減弱吉非替尼誘導(dǎo)的肺纖維化程度，為肺纖維化的治療提供一種新的思路，創(chuàng)造良好的社會(huì)價(jià)值及醫(yī)療價(jià)值。