王夢琳, 楊 慧, 金 娟

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌發(fā)病率及死亡率高于同期世界平均水平[1]。阿司匹林(aspirin，ASP)是傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥，2016年作為直結(jié)腸癌一級預防藥列入指南[2]，長期服用ASP可以降低發(fā)生結(jié)腸癌的風險、抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及改善直結(jié)腸癌患者術(shù)后生存率，對于其他癌癥如乳腺癌、胃癌、肝癌等的生長轉(zhuǎn)移也有一定抑制作用[3]。自噬是真核細胞中廣泛存在的現(xiàn)象，具有高度的保守性，涉及一系列連續(xù)事件，包括雙層膜的形成、伸長、囊泡的成熟及將包裹的細胞質(zhì)中受損的蛋白及受損的細胞器運輸至溶酶體降解，在營養(yǎng)不足、生長因子缺乏、缺氧等應激狀態(tài)下，細胞內(nèi)的自噬啟動，對維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)及細胞正常生長增殖有重要作用[4]。肝癌發(fā)生發(fā)展中自噬具有雙重作用，在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的初始階段抑制腫瘤的形成，在隨后的發(fā)展階段則促進腫瘤形成，并且自噬和肝癌細胞藥物抵抗有關(guān)[5]。該實驗旨在探究ASP對肝癌HepG2、SMMC- 7721細胞生長增殖作用及ASP對肝癌HepG2、SMMC- 7721細胞作用與自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人肝癌HepG2、SMMC- 7721細胞購于中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；ASP購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯喹(chloroquine,CQ)、二甲基亞砜(DMSO)及MTT購自美國Sigma公司；兔抗LC3單克隆抗體及兔抗mTOR單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗C9orf72多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗AMPK單克隆抗體購自蘇州百奇生物科技有限公司；小鼠抗β- actin、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG及辣根酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗儀器超純水儀(型號：NW 1 CUF)、三氣培養(yǎng)箱(型號：HF 100)購自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；超凈工作臺(型號：SW- CI- 2F)購自中日合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Counter Star全自動細胞計數(shù)儀(型號：IC 1 000)購自上海睿鈺生物科技有限公司；Muliskan GO酶標儀(型號：1510)購自美國Thermo Fisher科技公司；電泳儀(型號：PowerPacTMBasic)購自美國Bio- Rad公司；顯影儀(型號：4 600 Mini)購自上海歐翔科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) HepG2、SMMC- 7721細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，細胞匯合度達80%～90%時用0.25%胰酶進行消化與傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化離心收集細胞，接種于96孔板，每孔5 000個，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去原有培養(yǎng)液，PBS輕洗2遍，加入ASP(0、1.25、2.5、5、10、20 mmol/L)、40 μmol/L CQ及含有CQ的不同濃度ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)的DMEM溶液，每孔200 μl，每組設(shè)5個復孔，37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后，避光條件下每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml) 溶液，繼續(xù)孵育4 h后，棄去原有培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，室溫下?lián)u床上振動15 min溶解結(jié)晶，490 nm波長檢測吸光度(OD)值。細胞增殖率(%)=實驗組OD490/對照組OD490×100%。

1.3.3細胞克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化收集細胞，接種于6孔板中，每孔1 000個，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，貼壁后，更換聯(lián)合或不聯(lián)合CQ的含不同濃度ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)不含藥物的DMEM對照組，48 h后棄去含藥培養(yǎng)液，更換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 d。棄上清液，PBS漂洗2次，用含有0.1%結(jié)晶紫的4%多聚甲醛溶液固定染色30 min，緩慢流水輕輕沖洗洗去染液，倒置室溫干燥。拍照，計數(shù)肉眼可見克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)×100%。

1.3.4Western blot法測定蛋白表達 收集對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板中，分組同1.3.3，細胞匯合度達70%～80%時，更換不同含藥DMEM培養(yǎng)液，8 h后冰上裂解細胞提取細胞蛋白，BCA蛋白定量，變性后蛋白經(jīng)SDS- PAGE電泳、濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，TBST漂洗后，化學發(fā)光法顯影，Image J分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 ASP及聯(lián)合CQ對HepG2、SMMC- 7721細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，不同濃度ASP處理細胞后，與對照組相比ASP 1.25、2.5 mmol/L組對細胞增殖無抑制作用，但隨著ASP濃度增加其抑制作用增強，細胞增殖活性顯著降低(P<0.001，F(xiàn)HepG2=93.52，F(xiàn)SMMC- 7721=188.1)。ASP聯(lián)合自噬抑制劑CQ后，與單獨使用ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)比較，細胞增殖活性顯著降低(P<0.001，F(xiàn)HepG2=83.59，F(xiàn)SMMC- 7721=102.0)。見圖1。

圖1 ASP及聯(lián)合自噬抑制劑CQ后對肝癌細胞增殖的影響

A：HepG2；B：SMMC- 7721；與對照組比較：***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽▽▽P<0.001

2.2 ASP降低HepG2、SMMC- 7721細胞克隆形成細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)抑制細胞克隆形成(PHepG2<0.01，PSMMC- 7721<0.001，F(xiàn)HepG2=9.242，F(xiàn)SMMC- 7721=94.10)，ASP聯(lián)合自噬抑制劑CQ后兩種細胞克隆形成率與單獨使用ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)組相比進一步降低(P<0.001，F(xiàn)HepG2=64.56，F(xiàn)SMMC- 7721=158.00)。見圖2。

2.3 ASP及聯(lián)合CQ后對細胞AMPK、mTOR、LC3、C9orf72表達的影響ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)處理兩種肝癌細胞后同對照組相比，AMPK表達增加(PHepG2<0.01，PSMMC- 7721<0.5，F(xiàn)HepG2=13.27，F(xiàn)SMMC- 7721=5.112)，mTOR表達降低(PHepG2<0.001，PSMMC- 7721<0.001，F(xiàn)HepG2=31.52，F(xiàn)SMMC- 7721=45.81)，C9orf72表達增加(PHepG2<0.001，PSMMC- 7721<0.001，F(xiàn)HepG2=34.44，F(xiàn)SMMC- 7721=22.01)，HepG2細胞中LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加(P<0.01，F(xiàn)=8.328)，SMMC- 7721細胞中LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加不明顯。聯(lián)合自噬抑制劑CQ后同單獨使用對應ASP 1.25、2.5、5 mmol/L組相比，LC3 Ⅱ表達、LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加(PHepG2<0.001、0.001、0.01，F(xiàn)HepG2=28.65；PSMMC- 7721<0.01、0.05、0.01，F(xiàn)SMMC- 7721=11.12)，SMMC- 7721細胞中AMPK表達降低(P<0.001、0.001、0.01，F(xiàn)=23.64)，HepG2細胞中聯(lián)合CQ的ASP 2.5、5 mmol/L組AMPK表達降低(P<0.01，F(xiàn)=12.77)，ASP聯(lián)合自噬抑制劑CQ處理后的HepG2細胞中C9orf72表達增加(P<0.05、0.01、0.001，F(xiàn)=60.44)。見圖3、表1、2。

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，2010年全國肝癌發(fā)病率占全國癌癥發(fā)病率第三位，顯著高于同期全球、亞洲及發(fā)達地區(qū)；2012年我國肝癌患者死亡人數(shù)達38萬，占全球肝癌死亡人數(shù)的51%，占同期全國癌癥死亡總數(shù)的17.4%[1]。肝細胞癌是肝癌中最常見的一種，在HCC發(fā)生發(fā)展中自噬起著雙重作用，在損傷階段，酒精、病毒感染等因素可激活肝細胞中的自噬，敲除自噬相關(guān)基因(ATG)后，自噬發(fā)生受抑制，肝損傷增加，肝細胞在丙型肝炎病毒(HCV)的作用下更容易發(fā)生惡變[5]；而腫瘤形成后，自噬可以使肝癌細胞在缺血、缺氧環(huán)境中得以生存[6]。自噬的發(fā)生與肝癌細胞藥物抵抗有關(guān)，抑制自噬，肝癌細胞對抗癌藥物的敏感性增加，目前已有自噬抑制劑CQ、羥氯喹與抗癌藥物聯(lián)用進行的臨床試驗[5]。CQ是一種常見的自噬抑制劑，通過抑制自噬體與溶酶.體融合及融合后物質(zhì)降解抑制自噬[7]。

圖2 ASP及聯(lián)合自噬抑制劑CQ后對肝癌細胞增殖的影響及統(tǒng)計分析

A：HepG2；B：SMMC- 7721；C：HepG2細胞克隆形成率；D：SMMC- 7721 細胞克隆形成率；與對照組比較：*P<0.01，**P<0.01，***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽P<0.05，▽▽▽P<0.001)

圖3 ASP及聯(lián)合自噬抑制劑CQ后肝癌HepG2(A)、SMMC- 7721(B)細胞內(nèi)AMPK、mTOR、C9orf72、 LC3蛋白的表達

組別AMPKmTORC9orf72LC3Ⅱ/Ⅰ對照1.000±0.2001.000±0.0831.000±0.0431.508±0.172ASP 1.25 mmol/L1.804±0.3100.503±0.083???1.345±0.052???2.649±0.594?ASP 2.5 mmol/L3.551±0.824??0.767±0.097?1.333±0.063??2.587±0.300?ASP 5 mmol/L2.735±0.544??0.430±0.050???0.950±0.0833.110±0.437???CQ+ASP 1.25 mmol/L2.875±0.591??#0.677±0.082??#1.581±0.073???##5.187±0.358???###CQ+ASP 2.5 mmol/L1.274±0.076△△0.864±0.0491.546±0.107???△5.073±0.798???△△△CQ+ASP 5 mmol/L1.476±0.186▽▽0.216±0.050???▽▽2.232±0.179???▽▽▽4.460±0.165???▽▽

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽▽P<0.01，▽▽▽P<0.001

表2 各組SMMC- 7721細胞中AMPK、mTOR、C9orf72蛋白的表達及LC3 Ⅱ/Ⅰ比值

與對照組比較:*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與ASP 1.25 mmol/L組比較：#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；與ASP 2.5 mmol/L組比較：△P<0.05，△△△P<0.001；與ASP 5 mmol/L組比較：▽▽P<0.01

mTOR是真核細胞啟動自噬中一個關(guān)鍵的抑制性調(diào)節(jié)因子，受多條通路調(diào)節(jié)，激活mTOR的通路如Akt和MAPK信號通路，負調(diào)控mTOR的通路如AMPK和p53信號通路。mTOR抑制劑雷帕霉素作為常用自噬誘導劑顯示出了抗腫瘤作用[8]。人9號染色體72號開放閱讀框(Chromosome 9 open reading frame 72，C9orf72)基因非編碼區(qū)中GGGGCC序列病理性重復性擴增是額顳葉癡呆(FTD)和肌萎縮性脊髓硬化癥(ALS)的主要遺傳原因[9]，其編碼的C9orf72蛋白功能尚不明確。目前研究發(fā)現(xiàn)C9orf72與Rab1a和 ULK1復合物相互作用參與調(diào)節(jié)自噬起始[10]，與SMCR8和WDR41結(jié)合調(diào)節(jié)自噬溶酶體途徑，在C9orf72-/-小鼠中自噬受損[11]。但Ugolino et al[12]研究認為，敲低C9orf72后通過下調(diào)mTOR、活化TFEB信號，增強自噬活性。以上提示了C9orf72在自噬發(fā)生過程中發(fā)揮多重作用。

ASP抗HCC作用被廣泛研究，小劑量服用ASP可以降低患HCC的風險，乙型肝炎病毒相關(guān)HCC患者行肝切除術(shù)，術(shù)后使用ASP可有效改善患者預后[13]，小劑量ASP誘導HepG2細胞自噬，降低抗HCC作用[14]。本研究顯示，ASP(1.25、2.5、5 mmol/L)抗肝癌HepG2及SMMC- 7721細胞作用不明顯，聯(lián)合自噬抑制劑CQ后抑制作用增加。ASP處理兩種細胞后，細胞中C9orf72、AMPK表達增加， mTOR表達降低，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加，提示ASP(1.25、2.5、10 mmol/L)可能通過AMPK/mTOR通路激活自噬，C9orf72也可能參與其中；聯(lián)合自噬抑制劑后，CQ破壞自噬體和溶酶體融合及隨后內(nèi)容物的降解使自噬體細胞內(nèi)堆積，LC3 Ⅱ表達增加。綜上所述，CQ可以通過抑制自噬，增加ASP體外抗肝癌細胞的作用，但其機制還需進一步研究。