王澤棟,張林,李燁青,曾涵芳,朱靖,妥生海,韓兆玉
(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南京 210095)
荷斯坦牛具有產(chǎn)奶量高、耐寒卻不耐熱的特點(diǎn),高溫高濕的環(huán)境極易引起其熱應(yīng)激反應(yīng),造成健康狀況差、繁殖力低和高淘汰率等問題[1~5],給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)南方地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候,夏季高溫高濕,極端氣溫高達(dá)39.7℃,年平均降水量高達(dá)1 106mm,極易造成奶牛熱應(yīng)激。為了減少奶牛熱應(yīng)激的發(fā)生,奶牛養(yǎng)殖業(yè)已在營(yíng)養(yǎng)調(diào)控[6]、飼養(yǎng)管理等方面[7~9]投入了大量精力,但成效有限。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn),高產(chǎn)奶牛的長(zhǎng)期品種內(nèi)選育是造成奶牛熱敏感性上升、耐熱性能下降的重要原因之一,因此,通過多品種雜交選育兼顧產(chǎn)奶量和耐熱性的奶牛新品系可能是解決這一問題的重要途徑。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn),西門塔爾牛具有耐熱、耐粗飼、乳脂高、使用年限長(zhǎng)、繁殖力強(qiáng)等特點(diǎn),屬乳肉兼用型牛。據(jù)報(bào)道,荷斯坦牛與西門塔爾牛的雜交后代表現(xiàn)出很好的遺傳互補(bǔ)和雜種優(yōu)勢(shì),特別是耐熱性、繁殖性能和乳品質(zhì)方面表現(xiàn)突出[10~12]。因此,本研究以荷斯坦牛和西荷雜交牛為研究對(duì)象,通過檢測(cè)試驗(yàn)牛生理生化、抗氧化指標(biāo)和HSP70的變化,探索不同奶牛品種對(duì)長(zhǎng)期熱應(yīng)激的生理響應(yīng),以期為緩解南方地區(qū)奶牛熱應(yīng)激和選育耐熱性能優(yōu)良的奶牛品種提供參考。
本試驗(yàn)在南京衛(wèi)崗乳業(yè)西崗奶牛場(chǎng)進(jìn)行,選擇18月齡健康的中國(guó)荷斯坦牛和西荷雜交牛各8頭作為研究對(duì)象。其中,西荷雜交牛為西門塔爾牛(父本)和荷斯坦牛(母本)的雜交一代牛。飼養(yǎng)試驗(yàn)從4月初持續(xù)到8月底,跨越非熱應(yīng)激至熱應(yīng)激后期,從中選4個(gè)階段采樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo),分別為:非熱應(yīng)激期(4月1~3日)、熱應(yīng)激初期(6月1~3日)、熱應(yīng)激中期(7月16~18日)和熱應(yīng)激后期(8月26~28日)。試驗(yàn)期間牛群統(tǒng)一舍飼散養(yǎng),自由采食和飲水,日糧營(yíng)養(yǎng)水平參照南京衛(wèi)崗乳業(yè)西崗牧場(chǎng)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。
1.2.1 牛舍溫濕指數(shù)(THI)
試驗(yàn)期間分別測(cè)定牛舍的溫度和濕度,每個(gè)階段連續(xù)測(cè)定3d。在牛舍中部和四周距地面高1.5m的地方分別懸掛溫濕度表,每天8:00、14:00和20:00分別讀取牛舍的溫度(T,℃)和相對(duì)濕度(RH,%),并利用公式[13]計(jì)算THI,THI=(1.8×T+ 32)-(0.55-0.55×RH)×(1.8×T-26)。
1.2.2 直腸溫度和呼吸頻率
在試驗(yàn)期每階段的第3天,分別用獸用體溫計(jì)和秒表測(cè)定兩組牛的直腸溫度和呼吸頻率。
1.2.3 血清指標(biāo)
在試驗(yàn)期每階段的第3天,對(duì)兩組牛進(jìn)行尾靜脈采血(10mL)。血液樣品靜置1h后,經(jīng)3 000r/min離心15min,收集血清并置于-20℃下保存待測(cè)。
采用全自動(dòng)生化分析儀和酶標(biāo)儀測(cè)定血清指標(biāo)。檢測(cè)指標(biāo)包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、葡萄糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、Na+、Cl-、K+、Ca2+、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、皮質(zhì)醇(COR)和熱休克蛋白-70(HSP70)。試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程所。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后,用SPSS 20.0的GLM程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多重比較采用Duncan法。結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
研究[13]認(rèn)為,當(dāng)牛舍環(huán)境THI低于72時(shí),奶牛不會(huì)出現(xiàn)熱應(yīng)激;當(dāng)THI在72~78之間時(shí),奶牛會(huì)出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激;當(dāng)THI在78~88之間時(shí),奶牛會(huì)出現(xiàn)中度熱應(yīng)激;當(dāng)THI在89~98之間時(shí),奶牛會(huì)出現(xiàn)極嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激;當(dāng)THI大于98時(shí),奶牛將會(huì)死亡。由表1可知,在非熱應(yīng)激期,牛舍的日平均溫度為17.33℃,相對(duì)濕度為49.67%,THI值為61.74,此環(huán)境下試驗(yàn)牛不會(huì)產(chǎn)生熱應(yīng)激。在熱應(yīng)激前期,牛舍的日平均溫度為28.78℃,相對(duì)濕度為46.44%,THI值為76.19,此環(huán)境下奶牛會(huì)出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激;熱應(yīng)激中期時(shí),牛舍的日平均溫度達(dá)到32℃,相對(duì)濕度為47.11%,THI值為80.41,此環(huán)境下奶牛會(huì)出現(xiàn)中度熱應(yīng)激;熱應(yīng)激后期時(shí),牛舍的日平均溫度為27.78℃,相對(duì)濕度為52.78%,THI值為75.71,此環(huán)境下奶牛會(huì)出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激。
表1 牛舍環(huán)境的溫濕指數(shù)
表2 熱應(yīng)激對(duì)試驗(yàn)牛直腸溫度和呼吸頻率的影響
由表2可知,和非熱應(yīng)激期相比,當(dāng)出現(xiàn)熱應(yīng)激時(shí),荷斯坦牛的直腸溫度和呼吸頻率均顯著升高(P>0.05);西荷雜交牛的呼吸頻率顯著升高(P>0.05),而直腸溫度變化不顯著(P>0.05)。此外,在整個(gè)熱應(yīng)激期,西荷雜交牛的呼吸頻率均顯著低于荷斯坦牛(P>0.05)。結(jié)果表明,持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會(huì)引起荷斯坦牛和西荷雜交牛的直腸溫度和呼吸頻率的動(dòng)態(tài)變化;而西荷雜交牛能夠更好地維持直腸溫度和呼吸頻率的穩(wěn)定。
表3 熱應(yīng)激對(duì)試驗(yàn)牛血清生化指標(biāo)的影響
由表3可知,和非熱應(yīng)激期相比,整個(gè)熱應(yīng)激期內(nèi)荷斯坦牛和西荷雜交牛的TP、GLB、ALT和AST的含量均逐漸降低(P<0.05)。其中,ALB的含量先降低,升高到非熱應(yīng)激期水平后又顯著降低(P<0.05);GLU的含量逐漸降低,熱應(yīng)激后期時(shí)又升高到熱應(yīng)激前期水平,但整個(gè)熱應(yīng)激期均低于非熱應(yīng)激期(P<0.05)。整個(gè)熱應(yīng)激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的LDH含量均顯著增加(P<0.05),其中熱應(yīng)激前期西荷雜交牛的LDH顯著低于荷斯坦牛(P<0.05)。同時(shí),整個(gè)熱應(yīng)激期CK無(wú)顯著變化(P<0.05),但均低于非熱應(yīng)激期(P<0.05)。和非熱應(yīng)激期相比,整個(gè)熱應(yīng)激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的ALP含量均降低(P<0.05),其中荷斯坦牛的ALP含量先降低后升高,而西荷雜交牛的ALP含量逐漸降低。此外,結(jié)果還顯示,熱應(yīng)激中期和后期西荷雜交牛的GLB和AST顯著低于荷斯坦牛(P<0.05);熱應(yīng)激前期和后期西荷雜交牛的ALT顯著高于荷斯坦牛(P<0.05);熱應(yīng)激中期西荷雜交牛的ALP顯著高于荷斯坦牛(P<0.05),而到熱應(yīng)激后期時(shí)則顯著低于荷斯坦牛(P<0.05)。結(jié)果表明,持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會(huì)引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清生化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,其中GLB、ALT、AST和ALP兩品種間有顯著差異。
由表4可知,和非熱應(yīng)激期相比,熱應(yīng)激中期和后期荷斯坦牛和西荷雜交牛血清Na+含量均顯著升高(P<0.05)。在整個(gè)熱應(yīng)激期,荷斯坦牛和西荷雜交牛的Cl-逐漸升高,而Ca2+含量先升高后降低,但和非熱應(yīng)激期相比均無(wú)顯著差異(P<0.05)。和非熱應(yīng)激期相比,熱應(yīng)激期荷斯坦牛血清K+含量隨時(shí)間推移先降低后升高(P<0.05),而西荷雜交牛無(wú)顯著變化(P<0.05)。結(jié)果表明,持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會(huì)引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清離子的動(dòng)態(tài)變化,但兩組牛間無(wú)顯著差異。
表4 熱應(yīng)激對(duì)試驗(yàn)牛血清離子的影響 (mmol/L)
由表5可知,和非熱應(yīng)激期相比,處于熱應(yīng)激期時(shí)荷斯坦牛和西荷雜交牛的T-AOC和SOD均先升高后降低(P<0.05);MDA先降低后升高(P<0.05)。和非熱應(yīng)激期相比,熱應(yīng)激期荷斯坦牛的GSH-PX升高后降低(P<0.05),而西荷雜交牛無(wú)顯著差異(P<0.05)。此外,結(jié)果還顯示,熱應(yīng)激前期西荷雜交牛的T-AOC和SOD顯著高于荷斯坦牛(P<0.05);熱應(yīng)激后期西荷雜交牛的GSH-PX和SOD顯著高于荷斯坦牛(P<0.05),而西荷雜交牛的MDA顯著低于荷斯坦牛(P<0.05)。結(jié)果表明,持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會(huì)引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清抗氧化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,而西荷雜交牛的抗氧化能力優(yōu)于荷斯坦牛。
表5 熱應(yīng)激對(duì)試驗(yàn)牛血清抗氧化指標(biāo)的影響
圖1 熱應(yīng)激對(duì)試驗(yàn)牛血清COR和HSP70的影響
由圖1可知,和非熱應(yīng)激期相比,熱應(yīng)激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的COR均顯著降低(P<0.05),且先降低后升高;其中熱應(yīng)激前期兩組牛的COR顯著低于熱應(yīng)激后期(P<0.05)。和非熱應(yīng)激期相比,熱應(yīng)激前期和中期時(shí)荷斯坦牛和西荷雜交牛的HSP70含量均顯著升高(P<0.05),在熱應(yīng)激后期又降低至非熱應(yīng)激水平。此外,結(jié)果顯示,非熱應(yīng)激期、熱應(yīng)激前期和中期時(shí)西荷雜交牛的COR顯著高于荷斯坦牛(P<0.05);熱應(yīng)激前期、中期和后期西荷雜交牛的HSP70均顯著高于荷斯坦牛(P<0.05)。結(jié)果表明,持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會(huì)引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清中COR和HSP70的動(dòng)態(tài)變化,而西荷雜交牛在長(zhǎng)期熱應(yīng)激狀態(tài)下具有較好的耐熱性能。
家畜通過自身機(jī)制的調(diào)節(jié)可使其直腸溫度在一定的范圍內(nèi)上下波動(dòng)。當(dāng)奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)時(shí),直腸溫度會(huì)逐漸升高,奶牛的行為和生理生化指標(biāo)也將會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。本研究結(jié)果表明,熱應(yīng)激中期荷斯坦牛的直腸溫度顯著高于非熱應(yīng)激期(P<0.05);在整個(gè)試驗(yàn)期西荷雜交牛直腸溫度均無(wú)顯著變化。牛在正常情況下的呼吸頻率為20次/min,廖曉霞等[14]指出,當(dāng)奶牛處于輕度熱應(yīng)激時(shí),呼吸頻率為50~60次/min;中度等熱應(yīng)激時(shí)呼吸頻率為80~120次/min;嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激時(shí),呼吸頻率可達(dá)120~160次/min。這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致,本研究發(fā)現(xiàn),與非熱應(yīng)激期相比,熱應(yīng)激早期荷斯坦牛呼吸頻率升高了57.26%,西荷雜交牛升高了40.17%;熱應(yīng)激中期荷斯坦牛呼吸頻率升高了99.97%,西荷雜交牛升高了92.96%;熱應(yīng)激后期荷斯坦牛呼吸頻率升高了47.25%,西荷雜交牛升高了41.09%。另一方面,本研究結(jié)果表明,西荷雜交牛的呼吸頻率顯著低于對(duì)應(yīng)時(shí)期的荷斯坦牛(P<0.05),且增長(zhǎng)幅度小。有報(bào)道稱呼吸頻率過快必然導(dǎo)致奶牛心臟負(fù)荷增加,導(dǎo)致血液中CO2分壓下降,從而誘使機(jī)體發(fā)生呼吸性堿中毒[15]。由此表明,西荷雜交牛較適宜在熱應(yīng)激環(huán)境下生存,其耐熱性能優(yōu)于荷斯坦牛。
ALP是一種反映成骨細(xì)胞活性、骨生成狀況和鈣磷代謝的重要指標(biāo)[16],ALP活性降低意味著 ATP的分解減少,伴隨著血鈣和血磷含量減少。Perana等[17]研究結(jié)果表明,在熱應(yīng)激環(huán)境下ALP降低,這與本研究結(jié)果一致。CK是與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶[18],非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激時(shí)期西荷雜交牛的CK比荷斯坦牛高,但差異不顯著。GLU作為重要的營(yíng)養(yǎng)性單糖,是動(dòng)物代謝活動(dòng)快速供能最有效的營(yíng)養(yǎng)素。Scharf等[19]報(bào)道,急性熱應(yīng)激時(shí)肉牛血清GLU含量會(huì)升高,而慢性熱應(yīng)激時(shí)則會(huì)降低。血清中TP、ALB含量直接反映了動(dòng)物機(jī)體蛋白質(zhì)代謝的代謝狀況。蛋白質(zhì)代謝良好時(shí),血清中TP、ALB含量較低。本研究中,奶牛在夏季因氣候變化所引起的熱應(yīng)激當(dāng)屬于慢性熱應(yīng)激, 在該熱應(yīng)激期的3個(gè)階段, 試驗(yàn)牛血液中的GLU含量均呈現(xiàn)顯著下降,TP含量顯著下降,且西荷雜交牛TP含量下降程度更明顯,這說(shuō)明熱應(yīng)激對(duì)奶牛GLU代謝的影響更大,而西荷雜交牛蛋白質(zhì)代謝優(yōu)于荷斯坦牛。本研究還發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛和西荷雜交牛熱應(yīng)激狀態(tài)下血清LDH顯著升高(P<0.05),且西荷雜交牛在熱應(yīng)激前期LDH水平顯著低于荷斯坦牛(P<0.05)。原因可能是LDH參與了無(wú)氧酵解,LDH可能導(dǎo)致機(jī)體乳酸水平增加,引起酸中毒,而酸中毒會(huì)影響呼吸,使機(jī)體出現(xiàn)呼吸功能障礙,致機(jī)體缺氧。然而在此情況下,為保證中樞神經(jīng)、心臟等重要器官的供氧,其他組織極可能在缺氧情況下采取無(wú)氧酵解方式供能。而無(wú)氧酵解運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)時(shí),又會(huì)使機(jī)體LDH升高,這說(shuō)明西荷雜交??顾嶂卸灸芰?qiáng)于荷斯坦牛,抗熱應(yīng)激能力更強(qiáng)。
微量元素是機(jī)體必需的組成成分,對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體體液的pH值和維持穩(wěn)定的滲透壓具有重要的作用;另外,微量元素對(duì)應(yīng)激反應(yīng)中激素的合成和分泌、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、抗氧化以及免疫功能發(fā)揮都有重要作用[20~22]。血清中無(wú)機(jī)離子含量對(duì)牛的正常生理代謝具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激期間,荷斯坦牛和西荷雜交牛血清Cl-均顯著升高,其原因可能是在熱應(yīng)激早期,由于環(huán)境溫度變化,引起機(jī)體呼吸中樞興奮,使得呼吸頻率加快,血液CO2濃度下降,導(dǎo)致呼吸性堿中毒,從而使得腎分泌碳酸氫鹽的能力增強(qiáng),腎小管對(duì)Cl-的吸收增加,最終導(dǎo)致血清中Cl-含量增加[23]。這與Arad等[24]研究的熱應(yīng)激對(duì)雞血清電解質(zhì)含量影響的結(jié)果基本一致,說(shuō)明熱應(yīng)激影響了機(jī)體電解質(zhì)平衡。
正常生理狀態(tài)下,機(jī)體自由基的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡[25]。平衡一旦被打破,過高的自由基將會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物反應(yīng),產(chǎn)生丙二醛(MDA),從而造成細(xì)胞損傷。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶,能及時(shí)修復(fù)因自由基造成的損傷,是機(jī)體清除自由基的首要物質(zhì)。GSH-PX是機(jī)體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶,能還原有毒的過氧化物,從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。劉吉生等[26]研究證明,機(jī)體T-AOC活性越高,對(duì)自由基清除能力越強(qiáng),機(jī)體發(fā)生氧化損傷的幾率就越低。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)非熱應(yīng)激期和持續(xù)熱應(yīng)激階段對(duì)西荷雜交牛和荷斯坦??寡趸芰Φ挠绊戭愃疲粺釕?yīng)激早期西荷雜交牛的TAO-C、SOD活性均顯著高于荷斯坦牛(P<0.05),在熱應(yīng)激后期西荷雜交牛MDA水平顯著低于荷斯坦牛(P<0.05),而GSH-PX和SOD水平顯著高于荷斯坦牛。由此可知,西荷雜交牛相比荷斯坦牛對(duì)自由基的清除能力及還原過氧化物的能力更強(qiáng),故前者的抗氧化能力在熱應(yīng)激期高于后者。
腎上腺是動(dòng)物體內(nèi)對(duì)環(huán)境溫度(尤其是高溫)最為敏感的內(nèi)分泌腺。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)的激活并引起的糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、皮質(zhì)素)分泌量增加,都是應(yīng)激反應(yīng)最重要的特征。COR是腎上腺皮質(zhì)合成分泌的一種類固醇激素,參與機(jī)體多種代謝過程,有利于組織的修復(fù)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,持續(xù)熱應(yīng)激導(dǎo)致荷斯坦牛和西荷雜交牛血清中COR含量顯著下降,這與宋小珍等[27]研究的熱應(yīng)激對(duì)肉牛血清內(nèi)分泌激素含量影響的結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)非熱應(yīng)激期、熱應(yīng)激前期和熱應(yīng)激中期西荷雜交牛的COR顯著高于荷斯坦牛。Alderman等[28]報(bào)道,HSP70與環(huán)境溫濕度變化密切相關(guān),在生物熱耐受中起著主要作用。在環(huán)境變化應(yīng)激時(shí),產(chǎn)生的HSP70可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)下一次有害損傷的耐受程度,維持細(xì)胞的正常生理功能代謝,提高細(xì)胞生存率。陳強(qiáng)等[29]報(bào)道,熱應(yīng)激狀態(tài)時(shí),奶牛體內(nèi)HSP70基因的表達(dá)量會(huì)增加,說(shuō)明HSP70基因的表達(dá)對(duì)機(jī)體耐熱力的產(chǎn)生有重要的作用。HSP70在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較低或者不表達(dá),但是在熱應(yīng)激或者其他應(yīng)激源的作用下,表達(dá)量迅速增加。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激期間西荷雜交牛的HSP70顯著高于荷斯坦牛,顯示了西荷雜交牛具有的耐熱性。
綜上所述,持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境對(duì)荷斯坦牛和西荷雜交牛的生理指標(biāo)和機(jī)體代謝的影響是相似的,而西荷雜交牛在長(zhǎng)期熱應(yīng)激狀態(tài)下可表現(xiàn)出較好的耐熱性能。