王慧，劉伯承，段洪峰，何芳，杜麗飛，周望平，彭苗苗，楊俊

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131 )

奶牛乳房炎是制約奶業(yè)發(fā)展的常見疾病，其發(fā)病率高、防治困難、治療費用昂貴的特點給奶牛行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。奶牛乳房炎病因復(fù)雜，多由多種病原菌引起。細菌性乳房炎可使奶牛泌乳機能受損，減少泌乳量，引起生鮮乳質(zhì)量不達標(biāo)，導(dǎo)致生殖機能失調(diào)，影響發(fā)情率，奶牛生產(chǎn)性能降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，而且間接危害人類健康[1]。調(diào)查研究顯示，大約80%的臨床型乳房炎患牛乳汁中能夠檢出細菌，細菌種類多達20余種，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌為主，占奶牛乳房炎病例的80%以上[2,3]。目前治療奶牛乳房炎的藥物主要以抗生素為主，雖然抗生素在臨床上發(fā)揮了巨大的作用，但是由于使用不規(guī)范以及過度使用，往往導(dǎo)致藥物殘留，甚至可能導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)，治療效果降低，同時影響乳制品質(zhì)量和造成環(huán)境污染。為了避免以上問題，本試驗采集了湖南部分地區(qū)乳房炎奶牛的奶樣，進行主要病原微生物的分離鑒定，并通過藥敏試驗檢測其耐藥情況同時篩選出有效的治療藥物，從而為該地區(qū)制定奶牛乳房炎的治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備

PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、離心機、超凈工作臺、水浴鍋、移液槍、接種環(huán)。

1.1.2 主要試劑

血瓊脂平皿、營養(yǎng)肉湯、藥敏紙片，購自長沙市寶生盾生物科技有限公司；16S RNA通用引物，由華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集

于2018年6～7月，采集湖南某地區(qū)三個中等規(guī)模奶牛場臨床型乳房炎患牛乳樣74份。采樣前，先清洗乳頭，再對采樣乳區(qū)進行消毒處理，棄去前3把奶，然后取乳樣10mL，存放于4℃保溫箱中，并盡快送至實驗室檢驗。

1.2.2 奶牛乳房炎判斷標(biāo)準(zhǔn)

牛乳體細胞數(shù)（SCC）推薦分級標(biāo)準(zhǔn)參照國際乳業(yè)聯(lián)合會（IDF）的規(guī)定，其中SCC＜50萬個/mL為健康奶牛；100萬個/mL＞SCC＞50萬個/mL為隱性乳房炎；SCC＞100萬個/mL為臨床型乳房炎[4]。

1.2.3 細菌分離純化培養(yǎng)

用滅菌棉簽蘸取少許奶樣涂抹于血瓊脂平皿上，待奶樣完全吸收后倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12～18h，選取典型的優(yōu)勢菌落劃線接種于新的血瓊脂平皿上，繼續(xù)培養(yǎng)12～18h。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，初步鑒定細菌特征。

1.2.4 病原菌的PCR測序鑒定

對所有細菌均用 1 6 S R N A(2 7 F/1 4 9 2 R)通用引物進行擴增，序列為：2 7 F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，擴增片段長度為1 500bp左右，然后通過測序鑒定細菌的類別。挑取純培養(yǎng)后的細菌于滅菌純水中混合，于100℃水浴10min，再置于冰塊上10min以上，然后離心取上清液作為病原菌基因組的PCR模板，再進行基因片段的擴增，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，再進行基因測序，然后進行Blast比對，確定病原菌類別。最后采用普通肉湯進行增菌培養(yǎng)，用50%甘油于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 細菌耐藥性試驗

采用K-B紙片擴散法，對分離出的主要病原菌進行藥敏試驗，按照CLSI推薦的肉湯稀釋法及標(biāo)準(zhǔn)[5]判斷其耐藥性。選用的藥物有氨芐西林、四環(huán)素、青霉素、鏈霉素、丁胺卡那、頭孢拉啶、恩諾沙星、磺胺異噁唑。

2 結(jié)果與分析

2.1 主要病原菌分離株種類及比例

在采集的74份奶樣中，有56份奶樣分離到細菌，共88株細菌，采用病原菌的分離、純化以及16S RNA通用引物擴增測序比對判斷感染病原菌的類型。檢出率為77.78%（56/72），其中：金黃色葡萄球菌40株，占總分離菌株數(shù)的45.45%；表皮葡萄球菌2株，占總分離菌株數(shù)的2.27%；大腸桿菌16株，占總分離菌株數(shù)的18.18%；乳房鏈球菌12株，占總分離菌株數(shù)的13.64%；棒狀桿菌9株，占總分離菌株數(shù)的10.23%；其他細菌9株，占總分離菌株數(shù)的10.23%（表1）。由此可見，引起該地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病優(yōu)勢菌為葡萄球菌、乳房鏈球菌和大腸桿菌。

表1 樣品中主要病原菌分離株鑒定結(jié)果

2.2 病原菌的感染情況

經(jīng)過試驗統(tǒng)計分析，病原菌單獨感染的情況占57.14%（32/56），其中：金黃色葡萄球菌單獨感染的占35.72%，乳房鏈球菌單獨感染的占8.93%，大腸桿菌單獨感染的占7%?；旌细腥镜恼急葹?2.86%（表2），主要為金黃色葡萄球菌與其他病原菌的混合感染，棒狀桿菌沒有單獨感染的情況。

表2 病原菌感染情況

表3 主要病原菌藥敏試驗結(jié)果

2.3 藥物敏感性試驗結(jié)果

對分離到的主要病原菌包括金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌進行藥物敏感性試驗。金黃色葡萄球菌隨機選擇了21株進行試驗，乳房鏈球菌（12株）和大腸桿菌（16株）全部進行了試驗。參照CLSI判定標(biāo)準(zhǔn)比較抑菌圈直徑的大小，檢測病原菌對各種藥物的敏感程度。從表3可以看出，三種病原菌都有不同程度的耐藥性，金黃色葡萄球菌和乳房鏈球菌的耐藥性比較廣泛，大腸桿菌耐藥性相對較輕。其中三種病原菌對鏈霉素和磺胺異噁唑均有較高的耐藥性，另外金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對青霉素和氨芐西林也有較強的耐藥性，乳房鏈球菌對四環(huán)素有較強的耐藥性。只有頭孢拉啶和恩諾沙星對三種病原菌均有較強的殺滅和抑制作用。因此治療該地區(qū)奶牛乳房炎的首選藥物為頭孢拉啶和恩諾沙星，或第一代頭孢或氟奎諾酮類藥物。

3 討論

從本試驗的細菌分離結(jié)果可以看出，目前引起湖南部分地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原菌是金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌和棒狀桿菌，占致病菌總數(shù)的89.77%，其中金黃色葡萄球菌的分離率最高。與國內(nèi)其他地區(qū)的報道基本一致[6,7]，大多數(shù)奶牛乳房炎不止是由單一的某一種致病菌引起的，而是多種細菌共同感染所致，由表2的結(jié)果也可證實這一點。金黃色葡萄球菌主要損害乳房上皮細胞和腺泡的生理功能，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量下降[8]；大腸桿菌和乳房鏈球菌是奶牛場的常在菌，牛舍中的糞便、牛食用的草料以及牛床墊料等都存在這些環(huán)境性病原菌，加上南方濕熱的氣候更有利于環(huán)境中病原菌的滋生，從而導(dǎo)致大腸桿菌和乳房鏈球菌的易感性；棒狀桿菌可引起動物化膿性感染，可繼發(fā)奶牛乳房炎并使病情加重，加大治療難度。因此加強牛舍的環(huán)境消毒及擠奶過程的消毒，做好生物安全措施等對降低奶牛乳房炎的感染率具有重要作用，同時做好奶牛乳房保健、合理免疫、科學(xué)飼養(yǎng)等對于防控奶牛乳房炎也具有重大意義。

通過藥物敏感性試驗，表明奶牛乳房炎病原菌對臨床上常用的各種抗菌藥物均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，在本次試驗中耐藥性最嚴(yán)重的是鏈霉素和磺胺異噁唑，其次是青霉素和氨芐西林、四環(huán)素，只有頭孢拉啶和恩諾沙星的敏感性較強。這可能與奶牛場平時的治療習(xí)慣密切相關(guān)，過度使用或濫用抗生素以及用藥程序不規(guī)范等造成奶牛場常在菌耐藥的產(chǎn)生，由此導(dǎo)致治療效果不明顯，甚至大量的耐藥細菌感染或定植于牛乳中，可使耐藥細菌的傳播和耐藥基因從動物向人類轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更高。細菌對抗生素耐藥性的傳播和多重耐藥病原菌的發(fā)展已被世界衛(wèi)生組織認為是困擾人類細菌感染醫(yī)學(xué)治療的一個嚴(yán)重問題[9]。因此，對生鮮牛乳中主要病原微生物的分離鑒定以及常在致病菌耐藥性的檢測，可為解決獸藥殘留問題、地區(qū)常在致病菌耐藥問題和獸藥監(jiān)管體系建設(shè)與完善提供專業(yè)指導(dǎo)依據(jù)，為牧場或奶牛場的飼養(yǎng)管理提供更合理有效的用藥方案。

目前細菌耐藥性已經(jīng)引起全球廣泛關(guān)注與重視，歐美等奶業(yè)發(fā)達國家已頒布多項抗生素使用相關(guān)法律法規(guī)，并加強抗生素替代藥物的研發(fā)投入，同時建議建立測量細菌抗生素耐藥的實驗室標(biāo)準(zhǔn)，要求農(nóng)場主必須簽訂抗生素使用責(zé)任狀[9～11]。我國為了加強獸用抗生素等藥物管理，確保動物源性食品安全及公眾健康，原農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局在2017年組織起草了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017年-2020年）》，2018年國家又制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作方案》，力爭通過實施養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸用抗菌藥使用減量化行動試點工作，推廣獸用抗菌藥使用減量化模式等，實現(xiàn)獸用抗菌藥使用量“零增長”，同時獸藥殘留和動物細菌耐藥問題也得到有效控制。今后，如何在減少抗生素使用的同時能保障奶牛乳房炎得到有效治療，具有中國特色的中草藥、微生態(tài)等制劑或是中西醫(yī)結(jié)合治療，或?qū)⒊蔀檠芯康闹攸c。