彭帥，陳朗，鄭天宇，陸會寧，張麗，劉麗霞

（西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）位于單核/巨噬細胞等免疫細胞表面，同時也表達于上皮/牛胚氣管細胞等非免疫細胞中，能識別細菌、病毒、寄生蟲等多種病原微生物，是動物機體重要的模式識別受體[1,2]。自Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)第一個TLRs以來，至今已有10余個家族成員[4]。它們通過感知病原微生物（如細菌、真菌等）表達的特異性結構，即病原分子相關模式（PAMPs）和某些內源性配體，傳導病原微生物入侵信號并釋放炎癥因子等免疫活性物質，誘導機體產(chǎn)生固有免疫應答，進一步激活適應性免疫應答[5]。TLR2是一種跨膜糖蛋白，能夠識別病原體的細胞壁成分，激活免疫細胞內的信號傳導機制，使機體產(chǎn)生抗病性。目前，已經(jīng)證實牛TLR2基因被定位于17號染色體上[6]。TLR2作為固有免疫和適應性免疫之間的橋梁，在機體中發(fā)揮著重要作用[7]，成為?？共∮N的候選標記基因。

近年來，研究者對牛TLR2基因的結構功能、多態(tài)性及其與疾病的相關性做了大量研究。孫麗萍等研究表明，牛TLR2存在3個突變位點[8]。林寶山等利用熒光定量PCR，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因在牦牛小腸中有高表達現(xiàn)象[9]，且TLR2能識別并結合牛腸中的微小隱孢子蟲[10]。董慧敏[11]、葉小康[12]研究發(fā)現(xiàn)，病原微生物感染奶牛子宮后TLR2基因mRNA表達量明顯增加，并分析了其與子宮內膜炎的關聯(lián)性。Bhaladhare等發(fā)現(xiàn)牛TLR2基因存在3個SNP位點，并分析了其與結核病的相關性[13]。這些研究表明TLR2基因與許多免疫性疾病有關聯(lián)，并在調控免疫機理方面具有重要作用。

目前，有關大通牦牛TLR2基因的生物信息學研究還未見報道，為進一步探究其功能和作用機理，本研究采用DNA混合池擴增后直接測序的方法獲得大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)（編碼區(qū)Coding regions），并利用生物信息學軟件及網(wǎng)站預測分析大通牦牛TLR2蛋白的結構功能，為揭示該基因的基本性質和功能信息以及大通牦牛的抗病育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗血樣

本研究的試驗血樣采自青海大通牦牛種牛場的55頭大通牦牛，對其進行頸靜脈采血，采全血10mL，加ACD抗凝劑抗凝，利用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法抽提基因組DNA[14]。大通牦?；蚪MDNA以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2 引物設計與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的奶牛TLR2基因序列（登錄號AF368419），并引用周峰等已經(jīng)設計好的TLR2基因特異性引物[15]，分成五段進行擴增，預期擴增片段長度分別為522bp、822bp、574bp、526bp、599bp（表1）。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)引物序列

1.3 DNA混合池構建與PCR擴增

55個大通牦?；蚪MDNA樣品各取2μL，構建一個DNA混合池，以DNA混合池為模板進行擴增。擴增體系為20μL：DNA模板0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11μL，ddH2O 7.4μL。PCR條件：94℃ 5min預變性，94℃ 30s變性，58.5℃ 30s退火，72℃ 50s延伸，30次循環(huán)，72℃10min延伸，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 序列測定與拼接

五段PCR產(chǎn)物直接送蘇州金唯智生物科技有限公司進行純化后雙向測序，并使用MEGA6軟件[16]對大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)進行拼接。

1.5 生物信息學分析

利用生物信息學軟件及網(wǎng)站對大通牦牛TLR2蛋白結構、功能等進行預測與分析，所用軟件及網(wǎng)站見表2。

表2 生物信息學分析網(wǎng)站及軟件

2 結果與分析

2.1 大通牦牛TLR2蛋白理化性質預測分析

利用BioEdit軟件和ExPASy的在線程序Protparam預測TLR2蛋白的分子式、相對分子質量、等電點和氨基酸組成等基本性質（表3）。結果顯示，大通牦牛TLR2基因編碼784個氨基酸，20種氨基酸占比見圖1，亮氨酸（Leu）最多，占總氨基酸的15.43%，甲硫氨酸（Met）占比最少（1.40%）。

表3 大通牦牛TLR2蛋白質理化性質

圖1 大通牦牛TLR2蛋白質氨基酸組成

2.2 大通牦牛TLR2跨膜結構預測分析

應用TMHMM Server V.2.0分析跨膜結構。結果顯示，大通牦牛TLR2蛋白可能是由胞外區(qū)（1～587aa）、跨膜區(qū)（588～610aa）、胞內區(qū)（611～784aa）三部分組成的跨膜蛋白（圖2）。利用CDD工具[22]預測TLR2蛋白膜外區(qū)富集亮氨酸重復序列，可輔助識別病原微生物。

圖2 大通牦牛TLR2蛋白跨膜結構預測

2.3 大通牦牛TLR2蛋白信號肽預測分析

運用Signal P4.1軟件預測大通牦牛TLR2蛋白的N端信號肽及剪切位點，其準確度可達96%[23]。結果顯示，Cmax（0.692）、Ymax（0.800）均趨向于+1，S值在剪切位點之前連續(xù)偏高，剪切位點之后急劇降低，說明大通牦牛TLR2具有信號肽，剪切位點存在于20～21位氨基酸之間（圖3）。

圖3 大通牦牛TLR2信號肽預測

2.4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位點預測分析

圖4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位點預測

利用CBS的在線程序NetNGlyc預測大通牦牛TLR2蛋白的N-糖基化位點（圖4）。結果顯示，TLR2蛋白具有3個潛在的N-糖基化位點，分別為114位點、199位點和442位點。

2.5 大通牦牛TLR2 mRNA二級結構

利用在線程序（RNA fold web server 服務器）預測大通牦牛TLR2 mRNA二級結構（圖5）。結果顯示，其自由能為-677.40 kcal/mol，與荷斯坦牛二級結構自由能相差微小，但二級結構構型發(fā)生明顯變化[24,25]。

圖5 大通牦牛TLR2 mRNA二級結構

3 討論

TLR2作為TLRs的家族成員之一，活性居于前列，可與其他TLRs（如TLR1、TLR6）以及受體（如CD14）結合，產(chǎn)生強烈的免疫效應。目前國內外對于人及荷斯坦牛、鼠、鴨和羊等動物TLR2基因的研究已有大量報道[24～28]。

本研究通過蛋白質的理化性質、跨膜結構、信號肽、糖基化位點和mRNA二級結構分析TLR2基因的結構及功能。從預測結果看，TLR2蛋白是由784個氨基酸組成的不穩(wěn)定親水性跨膜蛋白質。大通牦牛TLR2蛋白理論等電點為6.46，由此可判斷大通牦牛TLR2蛋白是一種弱酸性蛋白質。研究表明蛋白質不穩(wěn)定指數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白，反之則為穩(wěn)定蛋白[29]，大通牦牛TLR2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.22，屬于不穩(wěn)定蛋白。依據(jù)總平均親水性（-0.120），可判斷大通牦牛TLR2蛋白是可溶性蛋白。通常蛋白質半衰期越長其結構越穩(wěn)定，大通牦牛TLR2蛋白半衰期為30h，但其卻是不穩(wěn)定蛋白，可能由于不同基因發(fā)揮不同功能而產(chǎn)生的相反結果。大通牦牛TLR2蛋白是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)構成的跨膜蛋白，與南陽黃牛TLR2蛋白組成一致[15]。研究表明牛TLR2可通過NF-Κb途徑誘導白細胞介素-1β的產(chǎn)生[30]，大通牦牛TLR2蛋白可能含有20個氨基酸組成的信號肽，南陽黃牛TLR2蛋白含有21個氨基酸組成的信號肽[15]，差別可能由于TLR2在不同種屬之間指導蛋白質跨膜轉移及分泌的功能強度差異所造成。蛋白質糖基化修飾對蛋白質折疊、分選及其定位有重要影響，大通牦牛TLR2蛋白具有3個潛在的N-糖基化位點，可能與其抗病性有關聯(lián)。mRNA二級結構同荷斯坦牛有明顯變化，可能與其優(yōu)越的抗寒性有關聯(lián)。

本研究對大通牦牛TLR2蛋白的理化性質和功能結構進行了預測分析，此后可在此基礎上深入研究TLR2基因的相對表達量，為大通牦牛的抗病育種提供理論基礎。