李艷華，呂小青，劉林，麻柱

（北京奶牛中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192）

在奶牛育種中，由于基因組選擇等現(xiàn)代分子育種技術(shù)的應(yīng)用，在極大地提高選擇準(zhǔn)確性的同時(shí)，也提高了選擇強(qiáng)度。由于人工授精（AI）等繁殖生物技術(shù)的應(yīng)用，使部分優(yōu)秀種公牛得到廣泛使用，增加了群體的近交系數(shù)，降低了群體有效含量，隱性基因純合的概率加大，使缺陷基因在奶牛群體中不斷涌現(xiàn)。隨著基因組學(xué)研究的不斷深入和高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，對(duì)奶牛隱性遺傳缺陷的挖據(jù)、鑒定與剔除速度不斷加快。

近年來(lái)，在荷斯坦牛群中不斷發(fā)現(xiàn)了許多有害單倍型或致死突變，其中大多數(shù)影響奶牛繁殖效率或增加胚胎死亡率，是新近在牛群中出現(xiàn)的隱性遺傳缺陷的新形式。當(dāng)這些有害單倍型隱性純合時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出不同類(lèi)型的臨床癥狀，如胚胎早期死亡等，是奶牛群繁殖健康的隱性殺手，嚴(yán)重影響著奶牛養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益[1～3]。

Fritz等[2]利用法國(guó)基因組選擇數(shù)據(jù)庫(kù)中47 878頭荷斯坦牛、16 833頭蒙貝利亞牛和11 466頭諾曼底牛的Illumina 50k 芯片分型數(shù)據(jù)，鑒定到34個(gè)在成活的個(gè)體中有明顯缺陷的純合子常見(jiàn)單倍型（頻率大于1%），每種單倍型均可能攜帶有害突變。數(shù)據(jù)分析表明，34個(gè)單倍型中有9個(gè)對(duì)繁殖性狀有顯著影響，其中包括6個(gè)新鑒定的單倍型：HH4、HH5、HH6、MH1、MH2和NH5。按照這種單倍型的命名慣例，第一個(gè)字母表示品種，第二個(gè)字母H表示單倍型，然后是順序號(hào)。VanRaden等[4]于2011年首次報(bào)道了3種單倍型：HH1、HH2和HH3，F(xiàn)ritz等[2]又命名了14個(gè)新荷斯坦牛單倍型HH4～HH17。

單倍型4（Holstein Haplotype 4，HH4）的致病機(jī)理是1號(hào)染色體上的GART（Glycinamide Ribonucleotide Transformylase，甘氨酰核糖核苷酸轉(zhuǎn)化酶）基因g.1277227A＞C突變，導(dǎo)致編碼區(qū)的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸（p.N290T），突變后致使GART基因功能喪失，阻礙了生物體中的嘌呤合成，最終導(dǎo)致胚胎在妊娠早期死亡[2]。本研究旨在對(duì)HH4單倍型在我國(guó)荷斯坦牛群中攜帶情況進(jìn)行摸底篩查，以掌握HH4單倍型在奶牛群中分布情況，為奶牛群的選種選配提供依據(jù)，為今后我國(guó)奶牛育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來(lái)自北京地區(qū)332頭種公牛凍精樣品及分布在24個(gè)奶牛場(chǎng)的1 151頭荷斯坦母牛血液樣品，采用高鹽法從牛凍精中提取基因組DNA[5]，采用試劑盒從血液中提取基因組DNA，然后使用微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA質(zhì)量，要求光密度比值OD260/OD280在1.8～2.1之間、OD260/OD230大于2.0、濃度均在100ng/μL以上為合格。

1.2 基因分型檢測(cè)

本研究選取MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜）檢測(cè)技術(shù)對(duì)HH4單倍型進(jìn)行基因分型。

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上牛AC_000158.1 (1265743..1292033)序列，利用AssayDesigner 3.1軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物。F/R:ACGTTGGATGTGAAGGTGTCCTCTATGCTG/ACGTTGGATGTTACTCACTTGGCACTCTGG；單堿基延伸引物：TCACCGAAACGGCAA。擴(kuò)增引物的終濃度為100μM，延伸引物的終濃度為500μM。

PCR反應(yīng)體系為：ddH2O1.8μL，10×PCR Buffer 0.5μL，MgCl2（25mM）0.4μL，dNTP Mix（25mM）0.1μL，Primer Mix（0.5μM）1μL，HotStar Taq（5U/μL）0.2μL，混合試劑按每孔4μL加到384個(gè)孔板中，模板加入體積為1μL，保證總的反應(yīng)體積為5μL。

擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 15min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃ 1min，45個(gè)循環(huán)；72℃ 3min；4℃保存。PCR反應(yīng)完成后進(jìn)行電泳，吸取2μL上樣緩沖液，1μL PCR產(chǎn)物，設(shè)定電壓為110V，電流為75mA，40min后觀察結(jié)果，如結(jié)果良好可繼續(xù)SAP反應(yīng)。

1.2.2 SAP反應(yīng)

在PCR產(chǎn)物中加入2μL堿性磷酸化酶（SAP，Sequenom）消化液：ddH2O1.53μL、緩沖液0.17μL、SAP 0.474U，以除去未用盡的dNTP，保證下一步單堿基延伸的正確性。此反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃40min，85℃ 5min，4℃保存。

1.2.3 單堿基延伸反應(yīng)及檢測(cè)

單堿基延伸反應(yīng)體系：ddH2O 0.619μL，iPLEX Buffer Plus 0.20μL，iPLEX Termination mix 0.20μL，iPLEX Extend Primer Mix 0.94μL，iPLEX Enzyme 0.041μL。反應(yīng)條件：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s，40個(gè)循環(huán)；80℃ 5s，5個(gè)循環(huán)；72℃ 3min；4℃保存。在終止反應(yīng)物中加入陽(yáng)離子交換樹(shù)脂脫鹽導(dǎo)入Assay中，樣本輸入、建板、點(diǎn)樣，然后進(jìn)行Mass Assay分析，質(zhì)控并收集最終數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)北京地區(qū)332頭荷斯坦公牛和1 051頭荷斯坦母牛進(jìn)行了HH4單倍型分型檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有樣本均為AA基因型正常個(gè)體，未檢測(cè)到攜帶者個(gè)體。分型散點(diǎn)圖如圖1所示。

圖1 GART基因分型散點(diǎn)圖

由圖1可見(jiàn)，通過(guò)Sequenom MassArray平臺(tái)對(duì)GART基因進(jìn)行分型檢測(cè)，在群體中僅檢測(cè)到一種基因型——AA型，在90°密集分布，且無(wú)檢測(cè)個(gè)體偏離正常的分布區(qū)域外，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 討論

HH4是新近在荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)的一種隱性致死單倍型，當(dāng)HH4單倍型隱性純合時(shí)，可導(dǎo)致奶牛胚胎早期致死，影響奶牛繁殖效率。2013年，F(xiàn)ritz等[2]報(bào)道了HH4遺傳缺陷單倍型在法國(guó)荷斯坦牛群體中的頻率為3.6%。如果攜帶者公牛與疑似攜帶者母牛交配，那么青年母牛妊娠率降低5.80%，經(jīng)產(chǎn)母牛妊娠率降低1.74%，嚴(yán)重影響奶牛繁殖性能，可給奶牛養(yǎng)殖者帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。而HH4單倍型在美國(guó)牛群中基因頻率較低，僅為0.37%[6]，說(shuō)明該遺傳缺陷單倍型在不同國(guó)家分布差異較大，其影響也是不同的。

本研究對(duì)北京地區(qū)332頭荷斯坦種公牛和1 151頭荷斯坦母牛進(jìn)行了HH4篩查，未檢測(cè)到HH4攜帶者個(gè)體，說(shuō)明北京地區(qū)的荷斯坦牛群基本不受HH4單倍型影響或影響很小，在奶牛場(chǎng)選種選配的時(shí)候可以不予考慮。勞蘭蘭等[7]研究表明，通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)466頭荷斯坦種公牛進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)6頭攜帶者，均可以追溯到共同祖先法國(guó)名牛Besne Buck（注冊(cè)號(hào)：HOFRAM4486041658），提示我國(guó)荷斯坦牛群體中HH4缺陷單倍型是在遺傳物質(zhì)的引進(jìn)過(guò)程中帶入的。據(jù)該研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)種公牛HH4攜帶率僅為1.2%左右[7]，進(jìn)一步印證了該缺陷單倍型在我國(guó)荷斯坦牛群中頻率較低，這可能是由于我國(guó)近年來(lái)主要從北美及澳大利亞等國(guó)引進(jìn)種牛遺傳物質(zhì)，而從歐洲引入遺傳物質(zhì)較少。

雖然HH4單倍型在我國(guó)荷斯坦牛群中攜帶率較低，對(duì)奶牛養(yǎng)殖影響不大，但其他新發(fā)現(xiàn)的單倍體如HH1、HH3、HH5～HH7等在我國(guó)牛群中的攜帶情況尚不清楚，建議繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究，以摸清這些新遺傳缺陷單倍型在我國(guó)荷斯坦牛群中的分布情況，進(jìn)一步指導(dǎo)奶牛群的選種選配及改良計(jì)劃。

4 結(jié)論

本研究利用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)北京地區(qū)全部荷斯坦公牛（332頭）及部分良種母牛（1151頭）的HH4單倍型攜帶情況進(jìn)行了篩查，結(jié)果表明，在所檢測(cè)的奶牛群體中，未檢測(cè)到HH4缺陷單倍型存在，其攜帶率為0。結(jié)果表明，北京地區(qū)的荷斯坦牛群不受HH4單倍型影響或影響很小，在進(jìn)行選種、選配的時(shí)候可以不予考慮。但是在進(jìn)口種牛遺傳物質(zhì)時(shí)，應(yīng)關(guān)注HH4攜帶情況，避免將該缺陷單倍型引入到我國(guó)荷斯坦牛群中，給我國(guó)奶牛養(yǎng)殖帶來(lái)潛在危害。