何大青 ，葉永華 ，方泗楊 ，楊 玲 ，許 文 ，葉 淼 ，鄭海音 ，徐 偉

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

鹽膚木（Rhus chinensis Mills.）為漆樹科（Anacardiaceae）鹽膚木屬（Rhus）落葉小喬木，在我國除東北、內(nèi)蒙古和新疆外，其余省區(qū)均有分布［1］。鹽膚木的現(xiàn)代研究多集中于藥食兩用的鹽膚木果［2-4］和其蟲癭（中藥名稱為五倍子）［5］，而對于鹽膚木（五倍子樹）藥材的其他用藥部位研究較少。根據(jù)福建省中藥材標(biāo)準(zhǔn)和廣東省藥材標(biāo)準(zhǔn)，鹽膚木用藥部位為其干燥根、莖，中醫(yī)理論認(rèn)為其可固陽補血、壯筋祛濕，臨床用于消腫、清熱解毒、活血化瘀等［6-7］。福州海王金象中藥制藥有限公司以鹽膚木作為單方制劑開發(fā)了舒冠通糖漿，臨床上用于抗冠心病治療，療效確切［8］。

然而，查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)研究情況，目前對鹽膚木藥材化學(xué)成分的提取研究很少，僅有針對黃酮類成分的提取工藝研究［9-10］，而從課題組前期的鹽膚木化學(xué)成分分離鑒定結(jié)果來看，鹽膚木中高含量成分多為酚酸類成分［11］?，F(xiàn)代藥理研究表明酚酸類成分具有良好的抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用［12］，可能是鹽膚木或者舒冠通糖漿的重要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并且課題組查閱文獻(xiàn)，以鹽膚木中總酚酸類部位進(jìn)行提取工藝的研究鮮見報道。因此本研究擬采用針對鹽膚木中總酚酸的部位，以其含量作為評價指標(biāo)，采用正交設(shè)計法優(yōu)化鹽膚木總酚酸的提取工藝，為鹽膚木總酚酸部位的現(xiàn)代中藥開發(fā)利用以及合理、經(jīng)濟、簡便工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津UV-1800型可見分光光度計（日本島津公司）；CPA225D型十萬分之一天平（德國Sartorius公司）；HC-2068高速離心機（安徽中佳科學(xué)儀器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFY-500型中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）。

1.2 材料 鹽膚木（批號：15122201）由安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)實驗室范世明鑒定為漆樹科鹽膚木屬鹽膚木（Rhus chinensis Mills）的干燥根，其標(biāo)本（編號：YFM 20151003）存放于福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心標(biāo)本室；沒食子酸（純度≥92.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204）；碳酸鈉、磷鉬鎢酸、乙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品12.5 mg，置于25 mL棕色量瓶中，加水充分溶解并稀釋至刻度，充分搖勻；再精密量取5 mL至50 mL量瓶中，并加水定容，搖勻，即得0.05 mg／mL對照品溶液。

2.2 含量測定 參照文獻(xiàn)［13］測定。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于 25 mL 棕色量瓶中，依次分別加入1 mL磷鉬鎢酸試液，再分別加入11.5、11.0、10.0、9.0、8.0、7.0 mL 水， 最后加入 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置35 min，以同樣方法處理試劑為空白顯色體系，在760 nm波長處測定吸光度。以吸光度（Y）對濃度（X）為進(jìn)行線性回歸計算，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程：

結(jié)果表明：沒食子酸在1.0～10.0 μg／mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 總酚酸測定 精密吸取各工藝考察的樣品溶液0.5 mL置于25 mL棕色量瓶中，依次加入1 mL磷鉬鎢酸試液、11.5 mL水，最后用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，靜置35 min，以同樣方法處理試劑為空白顯色體系，在760 nm波長處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總酚酸含量。

2.3 鹽膚木總酚酸提取工藝研究

2.3.1 單因素考察

2.3.1.1 評價指標(biāo) 以總酚酸提取率為評價指標(biāo)進(jìn)行各提取工藝考察。

2.3.1.2 乙醇提取濃度對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g，置于圓底燒瓶，提取液料比15∶1，乙醇提取溶劑比例分別設(shè)置為40%、50%、60%、70%、80%，浸泡 30 min，回流提取 1 h，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，結(jié)果見圖1。在40%～70%乙醇濃度，總酚酸提取率與乙醇提取濃度成正相關(guān)，在70%乙醇濃度時總酚酸提取率達(dá)到峰值，但在70%乙醇濃度之后，總酚酸提取率隨著乙醇提取濃度的升高而降低。初步確定乙醇提取濃度為50%～70%作為進(jìn)一步正交考察的水平。

2.3.1.3 液料比對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g置于圓底燒瓶中，分別加入5、10、15、20、25 倍量的 70%乙醇浸泡 30 min，回流提取1 h，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，結(jié)果見圖1。總酚酸的提取率隨著液料比的增大而增大，在液料比為20∶1后，總酚酸的提取率基本保持不變。因此選擇液料比為15∶1～25∶1作為進(jìn)一步正交考察的水平。

2.3.1.4 提取時間對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g置于圓底燒瓶中，加入20倍量的70%乙醇，浸泡30 min后，回流提取時間分別設(shè)置為 30、60、90、120、150 min，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，結(jié)果見圖1?？偡铀崽崛÷孰S著提取時間的增加而逐漸上升，在提取時間為120 min之后總酚酸的提取率基本不變。因此選擇提取時間為60～120 min作為進(jìn)一步正交考察的水平。

2.3.1.5 回流提取次數(shù)對總酚酸提取率的影響 精確稱取鹽膚木粉末5.0 g置于錐形瓶中，加入20倍量的70%乙醇，浸泡30 min，回流提取1 h，提取1、2、3、4 次，按照方法“2.2”項下測定每次鹽膚木提取液中總酚酸的含量，結(jié)果見圖1。隨著提取次數(shù)的增長，總酚酸提取率逐漸降低，在提取3次之后，總酚酸的提取率已提取完全。因此確定提取次數(shù)為1～3次作為進(jìn)一步正交考察的水平。

圖1 提取影響因素考察結(jié)果

2.3.2 正交設(shè)計試驗法 結(jié)合單因素實驗結(jié)果，利用DPS 14.0軟件正交設(shè)計試驗，選用L9（34）正交試驗方案，以乙醇提取濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）及提取次數(shù)（D）為考察因素，以總酚酸提取率為評價指標(biāo)，結(jié)果見表1。

試驗結(jié)果表明：以總酚酸含量為評價指標(biāo)，經(jīng)極差分析可知，總酚酸提取率的影響因素的順序分別為：C＞B＞D＞A，對A因素，其優(yōu)劣次序為A3＞A1＞A2；對 B 因素，其優(yōu)劣次序為 B2＞B3＞B1；對 C因素，其優(yōu)劣次序為C2＞C3＞C1；對D因素，其優(yōu)劣次序為 D2＞D3＞D1，故最佳提取工藝為 A3B2C2D2，即70%乙醇濃度，液料比20∶1，提取2次，提取時間90 min。

2.3.3 提取工藝驗證 按照正交實驗結(jié)果，取鹽膚木藥材5.0 g，加入20倍量70%乙醇，浸泡30 min，回流提取90 min，提取2次。平行提取3次，按照方法“2.2”項下測定鹽膚木中總酚酸的含量，總酚酸含量結(jié)果分別為 3.57%、3.57%和 3.59%，RSD為0.32%，平均含量為3.58%，表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討 論

前期化學(xué)研究表明鹽膚木酚酸類成分是其主要化學(xué)成分，主要包括鞣花酸、原兒茶醛、原兒茶酸、苔黑酚葡萄糖苷、對羥基苯甲酸等［11］，具有抗菌消炎、抑制細(xì)胞凋亡［14］、抗氧化［15］、神經(jīng)保護(hù)［16-17］等活性，與鹽膚木藥材的“消腫、清熱解毒、活血化瘀”作用相一致。因此鹽膚木總酚酸部位是鹽膚木的重要藥效物質(zhì)。

在鹽膚木總酚酸醇提工藝研究過程中，考察了乙醇提取濃度、液料比、提取時間、提取次數(shù)等因素對總酚酸提取率的影響，并進(jìn)一步采用正交設(shè)計優(yōu)化最佳的提取工藝，最后確定鹽膚木總酚酸的最佳提取工藝為乙醇提取濃度70%、液料比20∶1、提取時間90 min、提取次數(shù)2次。

本研究采用正交設(shè)計考察了鹽膚木總酚酸的醇提工藝和大孔樹脂法純化工藝，為鹽膚木總酚酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝提供參考，同時也為鹽膚總酚酸部位的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

致謝：本項目在福建省科技廳重點實驗室、福建省中藥資源研究與開發(fā)利用重點實驗室完成。