劉仁彬，姜錦林，張宇峰，梁霞，單正軍

1. 南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210009 2. 國(guó)家環(huán)境保護(hù)農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042

壬基酚聚氧乙烯醚(nonylphenol ethoxylates, NPEO)由壬基酚(nonylphenol, NP)和環(huán)氧乙烷加合而成，是全球使用量第二大的商用非離子表面活性劑[1]。因其性能穩(wěn)定、耐酸堿且價(jià)格低廉，被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、化妝品、紡織、造紙、印刷、農(nóng)藥、制藥、冶金、石油、合成橡膠、塑料甚至食品等產(chǎn)品的加工和生產(chǎn)[2-4]。近些年來(lái)，全球NPEO的年產(chǎn)量大約70萬(wàn)t[5]。隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，NPEO可以通過(guò)各種途徑釋放到環(huán)境中[6]。但在自然環(huán)境中，NPEO通常會(huì)降解成短鏈壬基酚聚氧乙烯醚、壬基酚和羧酸衍生物[7]。因此，這些降解產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)在廢水、地表水和沉積物中被檢測(cè)到[8]，NPEO及其降解產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的潛在影響受到人們的廣泛關(guān)注。NP已被證實(shí)具有很強(qiáng)的雌激素活性，被稱為內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[9-10]。NPEO及其降解產(chǎn)物大量進(jìn)入環(huán)境中，會(huì)對(duì)人體正常的激素分泌產(chǎn)生影響，造成致畸、致癌和致突變效應(yīng)，還可以通過(guò)食物鏈在動(dòng)物和人體內(nèi)積聚。研究表明，EDCs可以通過(guò)與天然激素相結(jié)合、模仿天然激素作用等方式引起內(nèi)分泌紊亂，對(duì)生物的發(fā)育和生殖產(chǎn)生影響，導(dǎo)致產(chǎn)卵量下降[11-12]。

截至目前，國(guó)內(nèi)外已對(duì)NPEO降解產(chǎn)物NP開(kāi)展了多項(xiàng)毒性效應(yīng)研究，低濃度的NP能夠抑制虹鱒魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育[13]。NP作為一種環(huán)境雌激素，能與雌激素受體結(jié)合，促使魚(yú)類體內(nèi)卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)的升高[14]。劉曉麗等[15]定量研究了NP對(duì)成熟雄性斑馬魚(yú)性腺細(xì)胞色素P450酶系表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)NP可以通過(guò)抑制精巢中雄激素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)影響精巢發(fā)育。但關(guān)于NPEO對(duì)魚(yú)類精巢組織結(jié)構(gòu)影響的研究不多，NPEO對(duì)魚(yú)類性腺發(fā)育影響的機(jī)理還不是很清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以成熟雄性斑馬魚(yú)(Daniorerio)為實(shí)驗(yàn)材料，探究不同濃度NPEO暴露對(duì)受試魚(yú)性腺中類固醇激素受體基因(ERα和AR)以及細(xì)胞色素P450酶基因表達(dá)量的影響，觀察斑馬魚(yú)精巢組織結(jié)構(gòu)的變化，深入探究NPEO對(duì)成熟雄性斑馬魚(yú)精巢組織結(jié)構(gòu)影響的作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與儀器

試劑：壬基酚聚氧乙烯醚(分析純)購(gòu)自阿拉丁化學(xué)公司，乙醇(分析純)和二甲苯(分析純)購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司，丙酮(分析純)購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，17β-雌二醇(>99%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

儀器：Leica DM4000 B顯微鏡，Bio-Rad Experion全自動(dòng)電泳系統(tǒng)，Bio-Rad Gel DocTMXR+凝膠成像分析系統(tǒng)，Bio-Rad CFX96TMReal-Time System熒光定量PCR儀，Bio-Rad DNA Engine PCR儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

斑馬魚(yú)購(gòu)自南京大學(xué)模式生物研究中心，為性成熟雄性個(gè)體，平均體重(0.315±0.064) g，在環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中心馴養(yǎng)2周以上，馴養(yǎng)魚(yú)用水為曝氣除氯后的自來(lái)水，每天定時(shí)投喂新鮮孵化的鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體(Artemianauplii)。

NPEO暴露設(shè)計(jì)：NPEO較難溶于水，需以丙酮作為助溶劑，配制成的母液濃度為500 mg·L-1(丙酮：5.0 mL·L-1)。設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)濃度組，分別為0.001、0.01、0.1、1.0和10.0 mg·L-1，設(shè)置雌二醇(E2：80.0 μg·L-1)試驗(yàn)組、空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。試驗(yàn)在10 L(含8 L暴露液)的玻璃缸中進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3組平行，每組平行隨機(jī)放入試驗(yàn)用魚(yú)30尾。采用半靜態(tài)水體暴露的方式進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)期間每天喂食3次，48 h更換一次暴露液，水溫控制在(25±2) ℃，光照周期14 h∶10 h，暴露周期為21 d。暴露21 d后取樣，取樣時(shí)將斑馬魚(yú)置于冰上，凍僵后迅速取精巢，立即放入液氮中速凍，放在-80 ℃冰箱中保存待用，精巢組織學(xué)研究的樣品用4%多聚甲醛固定待用。

1.3 斑馬魚(yú)精巢中相關(guān)基因的表達(dá)

采用高純總RNA快速抽提試劑盒(離心柱型)提取雄性斑馬魚(yú)性腺組織總RNA，取1L總RNA根據(jù)HiScriptTM1ST strand cDNA Synthesis kit的說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用CFX96TMReal-Time System進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括10 μL Faststart Universal SYBR Green Master，4 μL cDNA模板(反轉(zhuǎn)錄后按1∶10稀釋)，2 μL引物(6 mmol·L-1)，4 μL RNase-free water。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，55 ℃ 3 s，40個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)以減少誤差。通過(guò)分析反應(yīng)后各引物的溶解曲線來(lái)檢測(cè)目標(biāo)片段擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體或DNA污染物情況。用1%凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)片段擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度(標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照)。

本研究選擇β-actin基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè)雌激素受體α(ERα)、雄激素受體(AR)以及細(xì)胞色素P450酶基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，基因名稱、引物序列及序列號(hào)見(jiàn)表1。

1.4 總RNA的檢測(cè)

將提取的斑馬魚(yú)性腺組織的總RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：可觀察到清晰的28S、18S和5S rRNA條帶，說(shuō)明所提取的總RNA完整性較好，可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。另外，用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸收值及OD260/OD280比值，測(cè)得比值介于1.8～2.0之間，因此可用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

1.5 精巢組織石蠟切片

精巢組織學(xué)研究采用常規(guī)石蠟切片：取出固定好的精巢組織，經(jīng)梯度乙醇(50%～100%)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成石蠟切片(厚5 μm)。切片樣本經(jīng)二甲苯脫蠟和HE染色后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)基因表達(dá)量的計(jì)算。熒光實(shí)時(shí)定量得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，利用方差分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的數(shù)據(jù)差異，用Tukey法檢驗(yàn)計(jì)算P值，當(dāng)P<0.05、P<0.01時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 NPEO對(duì)斑馬魚(yú)精巢性類固醇激素受體基因表達(dá)的影響

經(jīng)過(guò)21 d的暴露，未觀察到斑馬魚(yú)出現(xiàn)死亡的情況。由圖1可知，不同濃度的NPEO暴露可以影響斑馬魚(yú)精巢中ERα和AR基因的相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照組相比，暴露于0.01和0.1 mg·L-1NPEO的斑馬魚(yú)精巢中ERα基因的表達(dá)量上調(diào)顯著(P<0.05)，10.0 mg·L-1NPEO處理組對(duì)斑馬魚(yú)精巢中ERα基因表達(dá)量的影響顯著(P<0.01)。僅10.0 mg·L-1的NPEO暴露顯著上調(diào)了斑馬魚(yú)精巢中AR基因的表達(dá)量(P<0.05)，其在低濃度NPEO的處理下沒(méi)有出現(xiàn)顯著性變化。

表1 基因名稱、引物序列和引物序列號(hào)Table 1 Gene name, sequence of the primers and accession number of primers

圖1 壬基酚聚氧乙烯醚(NPEO)對(duì)斑馬魚(yú) 精巢中ERα、AR基因表達(dá)的影響注：*P<0.05、**P<0.01，與對(duì)照組相比；CK、CP表示對(duì)照組和溶劑組。Fig. 1 Expression of ERα mRNA and AR mRNA in the testis of zebrafish exposed to nonylphenol ethoxylates (NPEO) Note: *P<0.05, **P<0.01, compared with the control; CK stands for control; CP stands for solvent control.

2.2 NPEO對(duì)斑馬魚(yú)精巢中細(xì)胞色素P450酶相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知，斑馬魚(yú)精巢中CYP17基因的表達(dá)量與NPEO的濃度存在明顯的負(fù)劑量-效應(yīng)關(guān)系，與對(duì)照組相比，在0.1 mg·L-1和10.0 mg·L-1NPEO的作用下，斑馬魚(yú)精巢中CYP17基因的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。在10.0 mg·L-1的NPEO暴露下，CYP19a基因的表達(dá)量最高，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 NPEO對(duì)斑馬魚(yú)精巢影響的組織學(xué)觀察

如圖3a和圖3b所示，雄性斑馬魚(yú)性腺為正常發(fā)育的精巢組織，由許多生精小管(ST)和管間結(jié)構(gòu)組成。精巢組織中可以看到精子(Sp)均勻分布于管腔中央及大小不一的生精小管中，每個(gè)生精小管內(nèi)含有處于精原細(xì)胞(Sg)、初級(jí)精母細(xì)胞(PS)、次級(jí)精母細(xì)胞(SS)和精細(xì)胞(St)等不同發(fā)育時(shí)期的生精小囊。在本研究涉及的濃度范圍內(nèi)，部分NPEO暴露組可導(dǎo)致成熟斑馬魚(yú)精巢組織結(jié)構(gòu)的改變。與對(duì)照組相比，在NPEO暴露21 d后的斑馬魚(yú)精巢組織切片中可以看到，0.001 mg·L-1的NPEO暴露組未對(duì)斑馬魚(yú)精巢組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響(圖3c)；0.01 mg·L-1NPEO處理組的斑馬魚(yú)精巢生精小管中處于精母細(xì)胞和精細(xì)胞時(shí)期的生精小囊數(shù)量減少，精子數(shù)量減少(圖3d)；0.1 mg·L-1NPEO處理組的斑馬魚(yú)生精小管管腔中精子密度增加，還出現(xiàn)了非細(xì)胞區(qū)域(圖3e)；1.0和10.0 mg·L-1NPEO處理組可見(jiàn)部分精子在生精小管管腔中央聚集，管腔內(nèi)空隙明顯增大(圖3f和圖3g)。

圖2 NPEO對(duì)斑馬魚(yú)精巢中性激素合成 酶基因CYP17、CYP19a表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of NPEO on the expression of steroidogenic genes CYP17, CYP19a in the testis of zebrafish

3 討論(Discussion)

研究結(jié)果顯示，在本研究所涉及到的NPEO濃度范圍內(nèi)，1.0 mg·L-1以上的NPEO暴露對(duì)ERα、AR和CYP17、CYP19a基因表達(dá)量的影響與E2對(duì)這些基因的影響明顯一致。E2是一種典型的雌性激素，可以誘導(dǎo)雄性動(dòng)物或未成熟的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生卵黃蛋白原，影響魚(yú)類的繁殖能力[16]，這顯示出NPEO暴露的類雌激素效應(yīng)。

研究表明，E2會(huì)對(duì)小鼠精巢中CYP17基因的表達(dá)產(chǎn)生干擾，減少睪酮的合成[17]。在脊椎動(dòng)物中，CYP17基因編碼的細(xì)胞色素P45017α-羥化酶是體內(nèi)雄激素合成的限速酶，可以控制精巢中性激素的合成量，主要分布于腎上腺和性腺的間質(zhì)細(xì)胞中[18]。在精巢中，P45017α-羥化酶將膽固醇轉(zhuǎn)化為睪酮[19]。本研究結(jié)果顯示，斑馬魚(yú)精巢中CYP17基因的表達(dá)量與NPEO的濃度存在明顯的負(fù)劑量-效應(yīng)關(guān)系，10.0 mg·L-1的NPEO暴露能顯著下調(diào)斑馬魚(yú)精巢中CYP17基因的表達(dá)量。類似的影響在BPA暴露實(shí)驗(yàn)中也存在，暴露于1 000 μg·L-1BPA的斑馬魚(yú)精巢中CYP17基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，表現(xiàn)出顯著的負(fù)劑量-效應(yīng)關(guān)系[20]。這說(shuō)明斑馬魚(yú)精巢中睪酮的合成減少，性激素分泌能力下降。由此可以推斷，NPEO暴露抑制斑馬魚(yú)精巢中CYP17基因表達(dá)是一種擬雌激素效應(yīng)。

魚(yú)類CYP19a基因編碼的P450芳香化酶(P450arom)是調(diào)控雌激素形成的關(guān)鍵酶，主要在卵巢中表達(dá)[21]，在雄魚(yú)精巢間質(zhì)細(xì)胞中僅有少量的表達(dá)，合成的雌激素參與調(diào)控原始精原細(xì)胞的增殖[22]。魚(yú)類精巢中ERα和CYP19a基因的表達(dá)量是環(huán)境雌激素對(duì)精巢影響的生物標(biāo)志物。研究結(jié)果顯示，NPEO暴露導(dǎo)致雄性斑馬魚(yú)精巢中CYP19a及ERα基因的表達(dá)量明顯增加。這說(shuō)明，NPEO暴露能夠促進(jìn)斑馬魚(yú)精巢中內(nèi)源雌激素的合成，干擾斑馬魚(yú)精巢中原有性激素的平衡。以往的研究表明，NPEO是一種弱雌激素，NPEO進(jìn)入環(huán)境后其EO鏈被打斷，形成保留1～2個(gè)EO的NP1EO和NP2EO，這些代謝物進(jìn)一步氧化成相應(yīng)的羧酸(NP1EC和NP2EC)，最終轉(zhuǎn)化為NP[23]。White等[24]證實(shí)4-壬基苯酚(NP)和4-壬基-苯氧基-雙氧乙烯醚(NP2EO)在虹鱒魚(yú)活體里具有一定雌激素活性，短鏈的NPEO在結(jié)構(gòu)上與NP比較接近，表現(xiàn)出的雌激素活性也接近NP。Metcalfe等[25]觀察到100 μg·L-1的NP1EO和NP2EO混合暴露組導(dǎo)致一條雄性青鳉出現(xiàn)雌雄間性。在0.1 mg·L-1的NPEO作用下，斑馬魚(yú)精巢中ERα基因的相對(duì)表達(dá)量顯著上升，與NPEO的弱雌激素效應(yīng)基本保持一致。而暴露于0.01 mg·L-1NPEO試液中的斑馬魚(yú)精巢中ERα基因的表達(dá)量也上調(diào)顯著，推測(cè)可能與其降解產(chǎn)物NP有關(guān)，例如Balch和Metcalfe[26]在NP1EO試液中檢測(cè)到降解產(chǎn)物NP存在，NP的存在也可能是促進(jìn)斑馬魚(yú)精巢中內(nèi)源雌激素合成的原因之一。NPEO進(jìn)入生物體后能形成包括NP1EO、NP2EO和NP在內(nèi)的多種相對(duì)穩(wěn)定的代謝物[23]，因此，NPEO降解產(chǎn)物對(duì)斑馬魚(yú)精巢發(fā)育的可能影響同樣不容忽視，所以需要進(jìn)一步研究它們之間聯(lián)合作用對(duì)斑馬魚(yú)的影響。以往的研究表明，ERα也可以通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)來(lái)影響CYP19基因的表達(dá)[27]。因此，NPEO暴露對(duì)斑馬魚(yú)精巢中CYP19a基因表達(dá)量的影響也可能是ERα正反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，BPA暴露可使金魚(yú)(Carassiusauratus)精巢中雄激素受體以及芳香化酶基因的表達(dá)量增加，BPA可以通過(guò)抗雄激素和雌激素雙重途徑減少金魚(yú)精子數(shù)量[28]。10.0 mg·L-1的NPEO暴露對(duì)斑馬魚(yú)精巢中AR基因的表達(dá)量有顯著影響，可以認(rèn)為NPEO對(duì)雄性斑馬魚(yú)精巢發(fā)育的影響存在抗雄激素和雌激素雙重效應(yīng)。

研究表明，高劑量E2暴露會(huì)使成熟雄魚(yú)精巢內(nèi)精液量下降，精子密度增加，并且有可能導(dǎo)致不育[29]，本研究中E2處理組觀察到的結(jié)果與其保持一致。研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，在1.0和10.0 mg·L-1NPEO處理組的斑馬魚(yú)精巢組織切片中可見(jiàn)，部分精子集中在生精小管管腔中央，明顯增大了管腔內(nèi)空隙。10.0 mg·L-1的NPEO暴露顯著上調(diào)了斑馬魚(yú)精巢中CYP19a基因的表達(dá)量，誘導(dǎo)內(nèi)源性雌激素的合成。由此可見(jiàn)，NPEO可能通過(guò)內(nèi)分泌干擾改變斑馬魚(yú)的精巢結(jié)構(gòu)，在NPEO與內(nèi)源雌激素的共同作用下，斑馬魚(yú)精巢生精小管內(nèi)產(chǎn)生精子濃縮效應(yīng)。因此，NPEO暴露會(huì)損傷斑馬魚(yú)成魚(yú)的精巢組織。

綜上所述，考察濃度范圍內(nèi)，NPEO暴露可以導(dǎo)致性成熟的雄性斑馬魚(yú)精巢發(fā)育退化，NPEO暴露對(duì)雄性斑馬魚(yú)精巢發(fā)育的影響存在抗雄激素和雌激素雙重效應(yīng)。NPEO作為一種弱雌激素，低濃度的NPEO(0.01 mg·L-1)通過(guò)降解產(chǎn)物NP對(duì)斑馬魚(yú)精巢中相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，影響斑馬魚(yú)精巢結(jié)構(gòu)。中高濃度的NPEO(≥0.1 mg·L-1)暴露通過(guò)抑制CYP17基因的表達(dá)干擾睪酮的合成；同時(shí)，NPEO暴露通過(guò)誘導(dǎo)CYP19a和ERα基因的表達(dá)增強(qiáng)雌激素效應(yīng)，增加內(nèi)源雌激素的合成，干擾斑馬魚(yú)精巢中原有的性激素平衡，最終導(dǎo)致斑馬魚(yú)成體精巢組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。需要注意的是，NPEO進(jìn)入生物體后可以形成包括NP1EO、NP2EO和NP在內(nèi)的多種代謝物，這些共存組分的雌激素效應(yīng)影響也不應(yīng)忽視。