胡靖飛，尹人杰，黃小波，2，3*，劉志鵬，趙玉佳，曹三杰，2，3，文心田，文翼平，趙 勤，伍 銳

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心，成都 611130；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)診斷技術(shù)四川科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級動物類實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，成都 611130）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、 豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和 A 型豬輪狀病毒（porcine rotavirus-A，PoRVA）是三種主要引起哺乳仔豬發(fā)生腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀的病毒，中大豬多呈隱形感染，2 周齡以內(nèi)的小豬發(fā)病率高， 致死率較高，其中PEDV 引起的死亡率高達(dá)70%～100%[1-3]。三者的流行病學(xué)、發(fā)病癥狀和病理病變相似，難以區(qū)分，特別是生產(chǎn)中三種病毒常呈混合感染。目前實(shí)驗(yàn)室診斷包括分子生物學(xué)診斷及免疫學(xué)診斷， 主要有RT-PCR[4]、LAMP[5]、ELISA[6]、免疫熒光和病毒分離鑒定[7]等。但是這些方法在臨床應(yīng)用中均存在耗時費(fèi)力，程序復(fù)雜，準(zhǔn)確性不高易出現(xiàn)假陽性，無法同時高通量鑒定混合感染等問題，因此，需要開發(fā)一種能同時對混合感染進(jìn)行高通量、快速便捷的檢測方法。

基因芯片技術(shù)的原理是通過堿基互補(bǔ)配對原則將固定在載體上的探針與樣品cDNA 進(jìn)行雜交，以標(biāo)記的信號報告分子獲得雜交信號[8]。T.R.Gingeras 等[9]建立了高密度DNA 芯片同時鑒定分枝桿菌菌種和結(jié)核分枝桿菌耐利福平rpo B 基因突變。T.L.Nicholson 等[10]針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型和豬呼吸道冠狀病毒設(shè)計了檢測基因芯片。N.Y.Park 等[11]建立了cy5 間接標(biāo)記的能同時對 PEDV、TGEV、PECV、PoRV A 群和 C 群等造成豬腹瀉病病毒的檢測芯片。

本實(shí)驗(yàn)室前期滑翔等[12]用間接熒光標(biāo)記技術(shù)和多重RT-PCR 技術(shù)相結(jié)合，建立了檢測3 種豬病毒性腹瀉的cDNA 基因芯片，馬銳等在此基礎(chǔ)上又對靶基因的直接熒光和間接熒光標(biāo)記方式進(jìn)行比較研究， 結(jié)果顯示引物直接熒光標(biāo)記法雜交的信號值、信噪比和靈敏度都優(yōu)于熒光間接標(biāo)記法[13]。但仍存在部分缺陷，如點(diǎn)制過程不穩(wěn)定造成探針點(diǎn)大小不均、洗滌處理不徹底、常規(guī)PCR 擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)生單鏈有限，雜交信號不穩(wěn)定等缺陷。為提升該病毒腹瀉cDNA 芯片的檢測效果與穩(wěn)定性，建立標(biāo)準(zhǔn)的芯片制備方法，本研究在前期滑翔等構(gòu)建的cDNA 芯片基礎(chǔ)上， 重點(diǎn)樣品標(biāo)記技術(shù)方面進(jìn)行了改進(jìn)，并對芯片制作與雜交的關(guān)鍵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，確定了PEDV-TGEV-GAR 共檢cDNA 基因芯片技術(shù)的最佳參數(shù)，為后續(xù)基因芯片的標(biāo)準(zhǔn)化制備與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

基因芯片點(diǎn)樣儀及掃描儀購自北京博奧生物公司；PCR 儀和分子雜交儀購于美國Thermo 公司；氨基載玻片、 點(diǎn)樣緩沖液購自上海百傲生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒購于美國Omega 公司；RNA 提取試劑盒購自上海生工公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和λ 定位基因購自 Takara 公司；2×Taq PCR Master Mix 購自天根生物公司；pMD-PEDV-S、pMD-PEDV-M、pMD- TGEV-S、pMD-TGEV-N、pMD-GAR-VP7、pMD-GAR-NSP4 重組質(zhì)粒菌， 均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心構(gòu)建保存。

1.2 引物設(shè)計

定位基因引物參考曹三杰等[14]設(shè)計合成。探針及靶基因引物參照滑翔[12]等設(shè)計的6 對引物，退火溫度在（55±2）℃范圍內(nèi)，由上海生工生物公司合成，其中反向引物為兩條，擴(kuò)增靶基因引物合成是在5′端用Cy3 修飾，擴(kuò)增探針的引物不作修飾（表1）。

1.3 基因芯片的設(shè)計和制備

將含探針基因的重組質(zhì)粒菌 （pMD-PEDV-S、pMD -PEDV -M、pMD -TGEV -S、pMD -TGEV -N、pMD-GAR-VP7、pMD-GAR-NSP4）復(fù)蘇培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒作為 PCR 擴(kuò)增模板。PCR 體系（50 μL）為：2×Taq PCR Master Mix 25 μL、 上下游引物各 2.0 μL、質(zhì)粒及定位基因 2.0 μL、ddH2O 補(bǔ)足至 50.0 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。產(chǎn)物用乙醇沉淀法純化后作為探針， 并與點(diǎn)樣緩沖液按1∶1 混合加入386 孔板，陰性對照為點(diǎn)樣液，按設(shè)計好的矩陣參數(shù)進(jìn)行接觸式點(diǎn)樣（圖1）。點(diǎn)樣結(jié)束后再經(jīng)過烘干、水合、紫外交聯(lián)和水洗4 個步驟，完成芯片的構(gòu)建。并將構(gòu)建好的芯片真空抽干，于4 ℃保存。

表1 靶基因及探針擴(kuò)增引物Table 1 Primers for target genes and probes amplification

圖1 基因芯片矩陣設(shè)計圖Figure 1 The design of DNA microarray spotting

1.4 芯片制備最佳條件優(yōu)化

1.4.1 點(diǎn)樣緩沖液的選擇及濃度優(yōu)化

由于點(diǎn)樣液為購買商品化， 成分公司未公開，因此不得而知，在使用過程中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用效果不夠理想，因此嘗試混合使用，選取博奧點(diǎn)樣液（CB）、百傲點(diǎn)樣液（BO），兩者分別按 1∶1、1∶2、2∶1 混合（點(diǎn)樣液中混有熒光），再分別與PM 探針按1∶1 比例混合。用點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣，置芯片掃描儀掃描。

1.4.2 水合時間優(yōu)化

將點(diǎn)制好的芯片置于80 ℃的雜交儀中（或密閉盒子放于烘箱中），烘干 8 h 后，分別按 0、2、4、6 s水合處理。紫外交聯(lián)30 min 后，置芯片掃描儀掃描分析。

1.4.3 探針基因濃度優(yōu)化

用點(diǎn)樣緩沖液將探針 PM（1.29×1010拷貝/μL）分別稀釋至 800、600、400、200、100、50 ng/μL，將不同濃度的探針基因分別點(diǎn)制在芯片上。再與PM 靶基因雜交，掃描分析結(jié)果，確定探針最佳點(diǎn)樣濃度。

1.4.4 洗液及干燥方式優(yōu)化

將芯片分別置于0.2%SDS 和超純水中上下抽提5 min，再將清洗后的芯片分別用離心機(jī)1 000 r/min甩干和自然晾干。

1.5 不對稱PCR靶基因引物比例優(yōu)化

以 PM、PS、TN、TS、NSP4，VP7 質(zhì)粒為模板，以5′端標(biāo)記有Cy3 的反向引物和非熒光正向引物，按照濃度比例為 1∶10、1∶20、1∶40、1∶50 進(jìn)行不對稱PCR 擴(kuò)增，同時設(shè)立 1∶1 比例的常規(guī) PCR 擴(kuò)增作對照組。反應(yīng)體系及程序同1.3，擴(kuò)增產(chǎn)物避光保存?zhèn)溆?。取上述擴(kuò)增產(chǎn)物，高溫變性后，與雜交緩沖液按1∶1 體積混合， 取混合液 50 μL 加入芯片區(qū)， 按照1.3 操作步驟雜交完畢后，立即洗滌，甩干、掃描分析。

1.6 雜交條件優(yōu)化

將1.5 中擴(kuò)增好的靶基因與雜交緩沖液以1∶1的比例混合， 然后將混合液于95 ℃變性3 min，迅速置于冰上冷卻后取50 μL 加到陣列上，置于雜交儀內(nèi)。（此步驟后避光操作）。選取同一批次制備的相同芯片，分別進(jìn)行雜交時間和雜交溫度的優(yōu)化。

1.6.1 雜交時間優(yōu)化

在48 ℃下與芯片雜交， 雜交時間分別為1、2、3、4、5 和6 h，掃描分析后確定最佳雜交時間。

1.6.2 雜交溫度優(yōu)化

使雜交盒中靶基因產(chǎn)物在 40、44、48 和 52 ℃溫度下雜交3 h，掃描分析確定最佳雜交溫度。

1.7 優(yōu)化后與前期芯片效果比較

將條件優(yōu)化后的芯片與前期制備的芯片按各自操作程序檢測已知PEDV 病毒核酸陽性的病料，比較雜交后效果。

1.8 共檢芯片的檢測效果驗(yàn)證

根據(jù)上述優(yōu)化后的最佳參數(shù)點(diǎn)制芯片，以5 份已知感染背景的臨床病料樣品，按芯片檢測流程進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該芯片的檢測效果。

2 結(jié)果

2.1 探針制備結(jié)果

提取靶基因重組質(zhì)粒， 擴(kuò)增獲得了與前期滑翔等報道大小一致的基因片段：PEDV-M：421 bp、PEDV-S：474 bp、TGEV-N：362 bp、TGEV-S：276 bp、GAR-NSP4：270 bp、GAR-VP7：381 bp（常規(guī) PCR 圖此處略）。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后即可用作芯片點(diǎn)樣探針。

2.2 芯片制備最佳條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 點(diǎn)樣緩沖液的選擇及濃度優(yōu)化

選取的兩種不同點(diǎn)樣液按不同比例混合后點(diǎn)樣，掃描分析。結(jié)果顯示，單獨(dú)使用CB 時，樣點(diǎn)小掃描效果不佳；單獨(dú)使用BO 時，樣點(diǎn)邊緣不規(guī)則且擴(kuò)散不均。兩者按2∶1 混合點(diǎn)樣，樣點(diǎn)擴(kuò)散不均勻，兩者按1∶1 混合，樣點(diǎn)大小合適，且擴(kuò)散均勻。因此在點(diǎn)樣時選取CB 與BO 按 1∶1 混合后加入探針（圖 2）。

2.2.2 水合時間優(yōu)化

比較不同水合時間，水合時間在0 s 時，樣點(diǎn)的大小不均勻；而超過4 s 以后，樣點(diǎn)擴(kuò)散過快，造成各樣點(diǎn)之間出現(xiàn)的粘連情況，不利于芯片雜交及掃描。水合4 s 比2 s，樣點(diǎn)更均勻，且擴(kuò)散效果更好（圖 3）。

圖2 點(diǎn)樣緩沖液優(yōu)化結(jié)果Figure 2 Optimization results of printing buffer

2.2.3 探針基因濃度優(yōu)化

探針基因濃度優(yōu)化結(jié)果表明（圖4），當(dāng)探針基因的濃度在 100 ng/μL 和 50 ng/μL 時 SNR＜2，無法判為陽性；在200 ng/μL 時，肉眼觀察斑點(diǎn)并不能準(zhǔn)確判定為陽性；而在 600～800 ng/μL 中，陽性標(biāo)記靶基因均能在雜交信號和肉眼觀察下直觀反映。綜合芯片制作成本， 本研究確定600 ng/μL 作為所有探針基因的固定濃度。

2.2.4 洗液及干燥方式優(yōu)化

用0.2% SDS 進(jìn)行清洗時， 對未固定上的探針清洗更為徹底，但相對來說背景值稍有提高。而在用超純水清洗時，背景值變化不大，但清洗效果不如用0.2% SDS。而在用自然晾干的方式進(jìn)行干燥處理時，背景值顯著提高，因此選用0.2% SDS 清洗，且 1 000 r/min 離心甩干（圖5）。

2.3 不對稱PCR靶基因引物比例優(yōu)化

選擇 1∶1、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50、1∶60、 1∶80、1∶160、1∶200 比例進(jìn)行不對稱PCR 擴(kuò)增，同時與常規(guī)PCR 擴(kuò)增作對照，雜交掃描分析（圖6）。由表2 可知，比例在 1∶20 與 1∶40 雜交效果均優(yōu)于常規(guī)PCR。綜合結(jié)果與成本， 選取1∶40 比例的不對稱PCR 擴(kuò)增來標(biāo)記靶基因。

2.4 雜交條件優(yōu)化

2.4.1 雜交時間優(yōu)化

圖3 水合時間的選擇結(jié)果Figure 3 Selection of hydration time

圖4 不同濃度探針結(jié)果Figure 4 The image of different concentration probes

雜交結(jié)果顯示，雜交時間在1～6 h 之間，均可判定為陽性雜交成立。且每個探針基因的信號中位值隨雜交時間而增加，而背景值也相應(yīng)增加。綜合考慮，雜交時間選擇3 h（圖7）。

2.4.2 雜交溫度優(yōu)化

圖5 洗液及干燥方式的選擇結(jié)果Figure 5 Selection of washing liquor and drying

圖6 不同比例不對稱PCR 擴(kuò)增雜交Figure 6 Different concentration ratio of the primers to asymmetric PCR

表2 不同比例不對稱PCR 熒光信號掃描結(jié)果Table 2 Signal intensity of different concentrations of asymmetric PCR

圖7 不同雜交時間的芯片結(jié)果Figure 7 Results at different hybridization time

由表3 及圖8 可知，隨著雜交溫度升高，信號隨之增強(qiáng)，同時背景值也會增強(qiáng)，在52 ℃時的背景值過大。在 40 ℃和 44 ℃時 NSP4 和 VP7 探針的信號值與其他探針差異較大， 而48 ℃時各探針信號差異較小， 因此選擇48 ℃為共檢芯片的最佳雜交溫度。

2.5 優(yōu)化前后芯片檢測效果對比

如圖9 所示，優(yōu)化前的芯片，樣點(diǎn)大小不均勻，雜交效果不理想，熒光重復(fù)性較差；相比而言，優(yōu)化過后樣點(diǎn)大小均一，熒光重復(fù)性好。

圖8 不同溫度的雜交結(jié)果Figure 8 Hybridization result at different temperature

2.6 共檢芯片檢測效果的驗(yàn)證

以確定的最佳參數(shù)條件構(gòu)建芯片，選取的5 份臨床樣品進(jìn)行效果驗(yàn)證，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板進(jìn)行不對稱PCR 擴(kuò)增標(biāo)記，再與芯片雜交，結(jié)果顯示檢測臨床樣品效果可靠， 與PCR 檢測結(jié)果一致（圖10）。

表3 不同雜交溫度的熒光信號掃描結(jié)果Table 3 Signal intensity at different hybridization temperatures

圖9 優(yōu)化前后效果比較Figure 9 DNA chip compared before and after optimization.

3 討論

本團(tuán)隊前期滑翔等[12]構(gòu)建了共檢PEDV、TGEV和PRoV 的cDNA 基因芯片， 本研究在重點(diǎn)在樣品標(biāo)記技術(shù)方面進(jìn)行了創(chuàng)新與改進(jìn)，采用直接熒光標(biāo)記與不對稱PCR 技術(shù)相結(jié)合提高芯片雜交信號，同時還對芯片制作與雜交的多個關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化研究。目前較常用的芯片載體包括膜片和玻片兩種， 玻片依賴于表面修飾的化學(xué)基團(tuán)與DNA形成Schiff 堿達(dá)到固定探針的作用[15-16]，本研究采用氨基硅化處理的玻片作為芯片的載體基片。烘焙和紫外交聯(lián)是為了讓探針基因更好的與基片表面共價結(jié)合。前期樣點(diǎn)大小不均或出現(xiàn)粘連情況，會使得掃描出的數(shù)據(jù)會有很大的誤差，本研究對點(diǎn)樣緩沖液的比例及水合時間進(jìn)行了逐一優(yōu)化，很好的控制了陣點(diǎn)的大小分布。探針基因濃度主要影響信號強(qiáng)度，靶基因量過剩，探針濃度越高信號強(qiáng)度則越趨于飽和，反之信號強(qiáng)度則越弱。

圖10 樣本檢測結(jié)果Figure 10 The detection results of known samples.

N.Y.Park 等[11]建立的對豬腹瀉病毒共檢的寡核苷酸芯片采用CY5 標(biāo)記dCTP 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，但CY5 對空氣中的O3比較敏感， 暴露在空氣中的CY5 易被其破壞，對結(jié)果分析會造成一定干擾[17]，因此本研究選擇CY3 進(jìn)行標(biāo)記[18]。本實(shí)驗(yàn)室前期對靶基因的直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法進(jìn)行了對比，結(jié)果表明直接標(biāo)記法的靈敏性是間接標(biāo)記法的100 倍[13]，所以直接采用了直接標(biāo)記法對靶基因下游引物標(biāo)記。前期采用多重PCR 方法進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增，獲得的靶基因單鏈有限。Kawai 的研究表明芯片雜交時，靶基因雙鏈中起雜交作用的實(shí)際上只是其中的一條鏈，而另一條鏈對雜交有一定抑制作用，使靶基因以雙鏈的雜交效率低于靶基因單鏈的雜交效率[19]。本研究以不對稱PCR 擴(kuò)增靶基因，目的是得到單鏈的雜交模板，進(jìn)一步提高雜交效率。不同靶基因擴(kuò)增的引物的不對稱比例有所不同，這與擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小和引物引導(dǎo)的擴(kuò)增的效率有一定關(guān)系[20]。通過比較上下游引物比例 1∶10～1∶200，從芯片雜交分析得出了正反向引物的最適比例為1∶40。并非單鏈量多則信號值高，雙鏈量多則信號值低。這與不對稱PCR 擴(kuò)增出單鏈和雙鏈比例有很大的關(guān)系。因此在以提高芯片雜交效率前提下，單獨(dú)判斷不同引物比例產(chǎn)生單鏈和雙鏈量無意義，而要綜合其擴(kuò)增靶基因產(chǎn)物與芯片雜交效率之間的關(guān)系。雜交溫度和雜交時間是影響雜交效果的兩個重要參數(shù)，本研究進(jìn)行了兩個參數(shù)的篩選，綜合比較各雜交條件的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)升高雜交溫度或是延長雜交時間都會使雜交信號呈現(xiàn)上升趨勢， 但是溫度過高、時間過長造成背景值升高，這是可能是由于雜交液隨時間延長蒸發(fā)過多，從而造成了背景值的升高，影響掃描儀對信號獲取[21]。同時，由于每種探針的序列不一致，最適雜交溫度也會有差異?；谶@兩點(diǎn)考慮通過篩選優(yōu)化，使中位值與背景值的比值即SNRm 值達(dá)到最大。

通過對3 種豬病毒性腹瀉共檢芯片的各項參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化選擇，同時以熒光直接標(biāo)記引物結(jié)合不對稱PCR 等方法， 進(jìn)一步提高該共檢芯片的檢測效果，為開展芯片的標(biāo)準(zhǔn)化制作和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。