袁 林,涂熠坤,2,曾 靜,郭建軍

(1.江西省科學(xué)院微生物研究所,江西 南昌330096;2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,江蘇 南京210000)

含有益生菌的微生態(tài)制劑能夠改善因長(zhǎng)期使用抗生素藥物所帶來(lái)的副作用,微生態(tài)制劑由于具有無(wú)藥物殘留、無(wú)毒副作用、細(xì)菌不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[1],且可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境,防治動(dòng)物腸道疾病,提高動(dòng)物的抗病能力和生產(chǎn)性能[2],因此,在養(yǎng)殖行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一,因具有改善消化道內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高動(dòng)物機(jī)體免疫力及產(chǎn)生多種酶類、提高消化酶活性等功能[3],故具有廣闊的發(fā)展前景,并在飼料添加劑、生物農(nóng)藥、污水處理、疫苗載體等[4]各方面已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。

枯草芽孢桿菌是一類好氧產(chǎn)芽孢的革蘭陽(yáng)性桿狀細(xì)菌,無(wú)莢膜,有鞭毛,能運(yùn)動(dòng),廣泛存在于土壤、湖泊、海洋和動(dòng)植物的體表,無(wú)致病性[5]。由于枯草芽孢桿菌具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單以及耐熱、可產(chǎn)抗逆芽孢等突出特征,在微生態(tài)制劑生產(chǎn)加工等環(huán)境中的易存活、定殖與繁殖,成本較低,施用方便,儲(chǔ)存期長(zhǎng)[6],現(xiàn)作為一種無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留、無(wú)抗藥性的綠色飼料添加劑重要菌種之一。但目前市場(chǎng)上大多數(shù)商品化的作為豬飼料添加劑的枯草芽孢桿菌都是從泥土和草地等自然環(huán)境中分離出來(lái)的,要想篩選出作為豬的飼料添加劑理想的菌種,應(yīng)優(yōu)選來(lái)源于豬腸道,經(jīng)過與豬共生長(zhǎng)期馴化的枯草芽孢桿菌,才能夠更好地適應(yīng)豬體內(nèi)環(huán)境、發(fā)揮更好的效果[7]。

本試驗(yàn)對(duì)從健康豬腸道內(nèi)容物、新鮮糞便及豬場(chǎng)周邊土壤中芽孢桿菌,進(jìn)行菌落形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rRNA 序列分析及同源性比較,研究了其生物學(xué)特性,以期得到高生物活性的益生菌菌株,為豬微生態(tài)飼料添加劑的開發(fā)提供候選菌株。

1 材料

1.1 樣品來(lái)源 采自江西贛州、上饒等地豬場(chǎng)健康豬腸道內(nèi)容物、新鮮糞便及豬場(chǎng)周邊土壤。

1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基(液體):可溶性淀粉3.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母膏3.0 g,磷酸氫二鈉2.0 g,磷酸氫二鉀1.5 g,硫酸鎂0.1 g,去離子水1 000 mL,pH 值7.5,121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基(固體):葡萄糖5.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母膏5.0 g,磷酸氫二鉀4.0 g,瓊脂粉18.0 g,去離子水1 000 mL,pH 值7.4,121 ℃滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基:氯化鈉10.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母粉5.0 g,去離子水1 000 mL,pH 值7.5,121 ℃滅菌20 min。

2 方法

2.1 菌株的分離與篩選 菌株的初篩:取新鮮仔豬糞25 g,與225 mL 富集培養(yǎng)基于三角瓶中混合均勻,30 ℃搖床培養(yǎng)過夜,將培養(yǎng)好的菌懸液置于80 ℃水浴鍋中處理15 min,然后取出靜置冷卻,吸取已經(jīng)進(jìn)行熱處理的培養(yǎng)液1 mL,用滅菌0.9%生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋至10-5、10-6、10-7三個(gè)濃度梯度,每個(gè)梯度重復(fù)3 次,通過平板涂布法接種于分離培養(yǎng)基上,于30 ℃溫箱培養(yǎng)24~48 h。挑取圓形、表面平整、不光滑、無(wú)光澤、邊緣不整齊的菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),培養(yǎng)好后取少量菌液進(jìn)行革蘭染色及芽孢染色觀察[8],對(duì)疑似菌落進(jìn)行分離純化,并將分離純化好的菌株于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株的復(fù)篩:將初步分離的疑似芽孢桿菌的單菌落分別點(diǎn)種到淀粉酶篩選培養(yǎng)基、CMC-Na 纖維素酶篩選培養(yǎng)基和干酪素培養(yǎng)基上[9],30 ℃下培養(yǎng)48 h,(1)在干酪素培養(yǎng)基上的菌落周圍產(chǎn)生透明的水解圈則表明該菌株具有產(chǎn)蛋白酶能力;(2)在淀粉酶篩選培養(yǎng)基上滴加盧戈氏碘液,觀察是否有水解環(huán)出現(xiàn),若菌落周圍產(chǎn)生透明水解圈則表明該菌株具有產(chǎn)淀粉酶能力;(3)在CMC-Na 纖維素酶篩選培養(yǎng)基上滴加剛果紅水溶液,靜置顯色30 min 后用蒸餾水洗去多余染液,再加入適量NaCl 溶液靜置洗脫30 min,最后再用蒸餾水清洗一次。若產(chǎn)生水解圈則表明該菌株具有產(chǎn)CMC 纖維素酶能力。每株菌株進(jìn)行至少3 次生物學(xué)重復(fù),通過比較測(cè)量的水解圈直徑大小(HD)和菌落直徑大小(CD)的比值(HD/CD)大小,篩選出具有較強(qiáng)產(chǎn)酶能力的菌株[10]。

2.2 菌株的特征鑒定 形態(tài)和生理生化特征鑒定:上述分離純化方法獲取疑似芽孢桿菌菌株按常規(guī)細(xì)菌生化試驗(yàn),根據(jù)革蘭染色后菌株形態(tài)學(xué)的特性,初步選取形態(tài)學(xué)特征較為明顯的菌株(革蘭陽(yáng)性、棒狀或短桿狀、有內(nèi)生芽孢)進(jìn)行生化特征分析[11]。參考《伯杰式細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版進(jìn)行鑒定,選擇接觸酶、糖/醇利用、V-P 反應(yīng)、淀粉水解、吲哚形成、明膠液化、纖維素水解、蛋白水解、硝酸鹽、檸檬酸鹽和硫化氫利用試驗(yàn)作為初步判斷枯草芽孢桿菌的特征性生化指標(biāo)[9-10]。

菌株分子生物學(xué)鑒定:使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(AXYGEN 公司),參考試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA 的提取。16S rRNA 基因保守序列使用通用引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′和27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL 反應(yīng)體系:10×Buffer 2.5 μL、模版DNA 1 μL,上下游引物各1 μL,dNTP 2 μL,Taq DNA 聚合酶0.5 μL,加無(wú)菌水至25 μL。PCR 條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,35 個(gè)循環(huán)。將16S rRNA 擴(kuò)增片段經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下觀察,并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AXYGEN 公司)對(duì)目的片段進(jìn)行回收,對(duì)回收后的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI 使用Blast 比對(duì),從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得與菌株16S rDNA 源的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù),使用Clustal X 1.8 將不同的序列對(duì)齊后,使用DNAman 5.1 構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3 菌株的生物學(xué)特性 耐酸試驗(yàn):取1 mL 菌株培養(yǎng)液加入pH 值3.0 的50 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃,120 r/min 搖床培養(yǎng),于0 h、3 h、6 h 和9 h進(jìn)行平板計(jì)數(shù),計(jì)算存活率,設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

耐膽鹽試驗(yàn):取1 mL 菌株培養(yǎng)液加入膽鹽濃度為0.5%50 mL 的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng),于0 h、4 h 和8 h 進(jìn)行平板計(jì)數(shù),計(jì)算存活率,設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

產(chǎn)酶能力:淀粉酶活性采用碘-淀粉比色法測(cè)定,蛋白酶活性采用福林酚法測(cè)定[12],纖維素酶活性采用羧甲基纖維素鈉鹽(CMC-Na)酶活性測(cè)定方法測(cè)定[13],脂肪酶活性采用橄欖油乳化液法測(cè)定[14]。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的篩選分離 從健康豬腸道內(nèi)容物、新鮮豬糞便及豬場(chǎng)周邊土壤等樣品中分離純化得到的菌株進(jìn)行革蘭染色,選取革蘭陽(yáng)性菌和有芽孢的菌落再做生化鑒定試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰式細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,篩選接觸酶、V-P 反應(yīng)、明膠水解、葡萄糖產(chǎn)酸和硝酸鹽利用為陽(yáng)性的菌株,初步確定了11 株疑似芽孢桿菌,分別 為GZ-0107、GZ-0183、FU-037、SR-096、MR-0302、GT-067、GT-082、GT-0126、GT-53、GT-0213 和WI-074,其結(jié)果見表1。

表1 菌株的生化鑒定結(jié)果

將初篩獲得疑似芽孢桿菌分別點(diǎn)種于淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶篩選培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48 h 后,測(cè)量不同篩選平板上單菌落的直徑(CD)和水解圈或透明圈的直徑(HD),通過比較HD/CD 的比值來(lái)判斷不同菌株產(chǎn)酶能力的大小。從表2 可以看出,能夠同時(shí)表現(xiàn)出淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的菌株共有8 株,MR-0302 只表現(xiàn)出淀粉酶酶活,GT-0126 和GT-0159 沒有表現(xiàn)出纖維素酶活,而GZ-0107、GZ-0183 和SR-096 這3 株菌具有較為明顯的高產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的綜合能力,尤其是SR-096菌株,其綜合產(chǎn)酶能力最為突出。

根據(jù)上述生化特征分析及產(chǎn)酶能力分析結(jié)果(見表1 和表2),選取8 株菌株,即GZ-0107、GZ-0183、FU-037、SR-096、GT-067、GT-082、GT-0213 和WI-074,16S rRNA 基因測(cè)序結(jié)果呈送GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄,收錄號(hào)分別為KP834902、KP834901、KP834904、 KP996671、 KP834899、 KP834898、KP834895 和KP834900。以16S rRNA 基因BLAST進(jìn)行序列同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1 所示,結(jié)果表明,FU-037 和WI-074 位于臘樣芽孢桿菌大分支中,FU-037 與蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)KJ722447 的相似性為 99.2%,WI-074 與蠟樣芽孢桿菌FJ210679 的相似性為99.1%;GZ-0107、GZ-0183、SR-096、GT-067、GT-082 和GT-0159 位于枯草芽孢桿菌大分支中,其中GZ-0183 與枯草芽孢桿菌KJ957013 的相似性達(dá)到99.6%。綜合生化特征和分子鑒定結(jié)果,認(rèn)為FU-037、GT-0213 和WI-074 為臘樣芽孢桿菌,GZ-0107、GZ-0183、SR-096、GT-067和GT-082 為枯草芽孢桿菌。

表2 芽孢桿菌產(chǎn)酶能力測(cè)定結(jié)果

圖1 芽孢桿菌的16S rRNA 基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 菌株生物學(xué)特性分析

3.2.1 耐酸耐膽鹽試驗(yàn) 從圖2 可看出,不同菌株間耐酸性存在較大差異,pH 值3.0 的環(huán)境下處理3 h 后GZ-0107、GZ-0183、SR-096 和的存活率分別為58.7%、77.2%、89.2%:處理6 h 后分別為41.7%、38.4%、82.5%;處理9 h 過程中,GZ-0107 存活率下降最明顯,SR-096 存活率仍在70%以上,耐酸能力明顯優(yōu)于另外兩株菌。

由圖3 結(jié)果可知,在高濃度膽鹽處理2 h 后GZ-0183 的存活率為51.9%;處理8 h 后SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 的存活率分別為46.7%、14.7%、19.8%。SR-096 在高濃度膽鹽處理后仍有以上的存活率,具有較強(qiáng)的耐膽鹽能力。

圖2 不同菌株間的耐酸性比較

圖3 不同菌株間的耐膽鹽比較

3.2.2 產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果 由表2 可以看出,菌株SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 都可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶,不同菌株產(chǎn)酶種類和能力不同。對(duì)于3株枯草芽孢桿菌,蛋白質(zhì)水解環(huán)直徑橫向比較差異不顯著,但在在培養(yǎng)28 h 后,SR-096 蛋白質(zhì)水解環(huán)直徑都顯著大于GZ-0107,GZ-0183(P<0.05);反映其產(chǎn)淀粉酶能力的染色圈直徑/菌落直徑(HD/CD)上發(fā)現(xiàn)SR-096 和GZ-0183 的水解環(huán)直徑顯著大于GZ-0107(P<0.05);反映其產(chǎn)纖維素酶能力的(HD/CD)及產(chǎn)脂肪酶能力的(HD/CD)數(shù)值上均為SR-096 最高,但菌株之間差異不明顯,說明菌株SR-096 具有較好的產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶能力水平。因發(fā)現(xiàn)平板法HD/CD不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力,所以對(duì)產(chǎn)酶菌株進(jìn)行發(fā)酵液法胞外酶產(chǎn)酶活性測(cè)定是非常必要的。由表3 可以看出,菌株SR-096 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶活力顯著高于菌株GZ-0107 和GZ-0183、在纖維素酶和脂肪酶活力只是在數(shù)值上較高,與初篩結(jié)果基本一致。

表3 不同菌株發(fā)酵液的胞外酶活性 (U/mL)

4 討論

微生態(tài)制劑在生產(chǎn)過程中一般把篩選益生菌作為關(guān)鍵的一步,因?yàn)榉N屬特異性是篩選合適益生菌的一個(gè)先決條件,不同來(lái)源的芽孢桿菌在不同動(dòng)物胃腸道內(nèi)的粘附繁殖能力及相關(guān)生理功能有所不同[15]。本試驗(yàn)菌株是從豬腸道內(nèi)容物、糞便、土壤等中分離純化,先通過傳統(tǒng)方法對(duì)分離出來(lái)的菌株做菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢和生理生化檢測(cè),然后運(yùn)用16S rDNA 核酸序列分析及同源性比較進(jìn)行菌株鑒定,這樣可以最大程度地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和客觀性。試驗(yàn)中分離出在菌落形態(tài)和生理生化特性與標(biāo)準(zhǔn)枯草芽孢桿菌基本吻合的疑似菌株11株,其中8 株能夠同時(shí)表現(xiàn)出產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶能力;16S rRNA 核酸全序列測(cè)序和同源性比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)有5 株與枯草芽孢桿菌的同源性最高,達(dá)到99%以上。經(jīng)細(xì)菌的菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢、生化試驗(yàn)以及16S rRNA 序列分析及同源性比較,綜合確定菌株SR-096、GZ-0183 和GZ-0107 為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌作為益生菌,因枯草芽桿菌在缺乏營(yíng)養(yǎng)或不良環(huán)境時(shí),通過生成內(nèi)生孢子來(lái)增強(qiáng)抵抗腸道逆境條件,而表現(xiàn)出耐胃酸、耐膽鹽、耐加工、耐儲(chǔ)藏、穩(wěn)定性等特性,還具有分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力[16]。這些外源性的消化酶,參與動(dòng)物消化道的酶池,在一定程度上幫助降解動(dòng)植物性飼料中復(fù)雜的有機(jī)物,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高飼料利用率。因此,芽孢桿菌作為益生菌制劑開發(fā)應(yīng)用的潛力很大。本試驗(yàn)采用平板透明圈法結(jié)合胞外酶活性測(cè)定,對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶情況進(jìn)行分析,初步反映出產(chǎn)酶活力的高低,產(chǎn)酶能力越高,水解圈越大;產(chǎn)酶速度越快,水解圈出現(xiàn)的越早。培養(yǎng)液法胞外酶產(chǎn)酶活性與平板透明圈法反應(yīng)的酶活基本一致。其中枯草芽孢桿菌SR-096 產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶能力的表現(xiàn)較為顯著,具有較高的綜合產(chǎn)酶能力,其可以在畜牧養(yǎng)殖中用來(lái)高效轉(zhuǎn)化飼料中的淀粉、蛋白質(zhì)和纖維素,這為今后將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供了重要的理論依據(jù)。