靳雙星,張桂枝,王學(xué)強(qiáng),張 瀟

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州450046;2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物科技學(xué)院,河南 鄭州450046;3.開封市動物疫病預(yù)防控制中心,河南 開封475000)

近年來,通過微生物發(fā)酵手段炮制中藥的研究越來越受到重視,并取得了一定進(jìn)展[1-4],發(fā)酵過程可以改變中藥的原始生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分,經(jīng)過微生物發(fā)酵處理后的中藥富含維生素、酶和生長因子[5-6]。發(fā)酵中藥與未發(fā)酵中藥相比,可較大幅度地改變藥性,提高療效,降低毒副作用,擴(kuò)大適應(yīng)癥,已成為中藥研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[7]。現(xiàn)代藥理研究顯示,補(bǔ)中益氣湯具有調(diào)整胃腸運(yùn)動,調(diào)節(jié)胃酸與胃蛋白酶分泌,增強(qiáng)小腸對葡萄糖吸收,增加胰液分泌等功效[8-10]。因此,本課題組根據(jù)中獸醫(yī)理論及養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐研制出補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑。為探討其對肉雞腸道環(huán)境和黏膜結(jié)構(gòu)的影響,在飼料中添加不同劑量的補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑,測定腸道主要菌群數(shù)量、酶活性、pH 值及黏膜結(jié)構(gòu)等指標(biāo)的變化,為該制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品 補(bǔ)中益氣湯是由黃芪、黨參、白術(shù)、當(dāng)歸、柴胡、升麻、陳皮、甘草等8 味中藥組成的。發(fā)酵方法參考張桂枝的文獻(xiàn)[11]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 1 日齡健康A(chǔ)A 肉雞,隔離飼養(yǎng)至7 日齡,選取300 只體重相近健康的肉仔雞,隨機(jī)分為4 組,每組設(shè)置5 個重復(fù),每個重復(fù)15 只肉雞,自由采食和飲水,分籠飼養(yǎng),試驗(yàn)期間各組飼養(yǎng)管理?xiàng)l件完全一致。 空白對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,中藥對照組在基礎(chǔ)日糧中按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加1%未發(fā)酵補(bǔ)中益氣湯中藥,試驗(yàn)1、2 組在基礎(chǔ)日糧中按質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別添加0.5%、1%補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑,混飼,連續(xù)添加。各組肉雞均在7 日齡1.5 倍量點(diǎn)眼滴鼻免疫接種新城疫活疫苗(LaSota株);21 日齡2.5 倍量飲水免疫接種新城疫活疫苗(LaSota 株)。

1.3 主要試劑 淀粉酶檢測試劑盒、蛋白酶檢測試劑盒、脂肪酶檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);新城疫活疫苗(LaSota 株)(購自齊魯動物保健品有限公司)。

1.4 主要儀器 生化培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、奧林巴斯生物顯微鏡、pHS-3B 型酸度計(jì)、離心機(jī)、無菌操作臺、微型振蕩器、微量移液槍、高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.5 檢測指標(biāo)及測定方法

1.5.1 腸道菌群數(shù)量的測定 在21、35 日齡時,每組隨機(jī)選取6 只健康肉雞,屠宰后,立即剖開腹部并截取回腸、盲腸各4 cm 左右,兩端用細(xì)繩結(jié)扎,用75%酒精消毒接扎口,裝進(jìn)滅菌袋子里,-20 ℃冰箱保存。檢測時取待測腸段食糜,在超凈工作臺上稱取0.5 g 腸道食糜,放進(jìn)提前滅菌過的試管內(nèi),加入滅菌生理鹽水4.5 mL 后,振蕩5 min,用滅菌紗布過濾,取0.5 mL 上清加入第二個試管中,按照上述步驟重復(fù)進(jìn)行10 倍稀釋,然后取104~106倍稀釋液各50 μL 接種在麥康凱和LBS 培養(yǎng)基上,麥康凱培養(yǎng)基37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,LBS 培養(yǎng)基37 ℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,計(jì)數(shù),求出每克食糜所含的細(xì)菌數(shù),單位用(CFU/g)表示。

1.5.2 腸道酶活性的測定 在21 日齡和35 日齡,每組抽取6 只正常肉雞,屠宰后立刻取十二指腸、空腸和盲腸內(nèi)容物4 g,迅速攪拌均勻,放入離心管置于-20 ℃的冰箱中保存。測定前,將樣品在冰上解凍,進(jìn)行10 倍稀釋,混勻后放置在離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min,取上清液,按試劑盒說明書測定脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶酶活性。

1.5.3 腸道pH 值的測定 在21、35 日齡,每組抽取6 只正常肉雞,屠宰后,迅速打開腹腔,取出十二指腸、空腸、回腸、盲腸的內(nèi)容物各1 g 放置在離心管內(nèi),按照1 ∶8 的比例加入超純水(調(diào)節(jié)pH值7.0),振蕩混勻,用酸度計(jì)測pH 值。

1.5.4 腸道組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)測定 分別在21、35 日齡時,每組隨機(jī)抽取6 只健康肉雞,屠宰后,打開腹腔,截取卵黃蒂后1 cm 位置回腸腸管3~4 cm,用裝有生理鹽水的注射器在不損壞腸絨毛結(jié)構(gòu)的前提下,沖去腸道內(nèi)容物,然后將腸道兩端結(jié)扎,并注入適量的10%甲醛磷酸緩沖液,然后放入緩沖液中固定4~6 h 后,剪去結(jié)扎的兩端,制作組織切片,觀察肉雞的腸道組織結(jié)構(gòu)。選取測定樣本最厚腸壁厚度、最深隱窩深度和最長絨毛長度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,并用Duncan′s 法檢驗(yàn)顯著性,以P<0.05 作為是否有差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn);試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道菌群數(shù)量的影響 由表1 可知,回腸與盲腸乳酸桿菌數(shù)量均有不同程度增加。試驗(yàn)1、2 組回腸乳酸桿菌數(shù)量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05),試驗(yàn)2 組21 日齡及試驗(yàn)1 組35 日齡盲腸乳酸桿菌數(shù)量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。中藥對照組與空白對照組相比,乳酸桿菌數(shù)量沒有明顯差異(P>0.05);而在35 日齡回腸、盲腸乳酸桿菌數(shù)量與試驗(yàn)1 組相比差異明顯(P<0.05),中藥對照組回腸乳酸桿菌數(shù)量與試驗(yàn)2 組相比差異顯著(P<0.05)。在肉雞日糧中添加入不同劑量發(fā)酵中藥,大腸桿菌數(shù)量均有不同程度減少。21 日齡時,試驗(yàn)2 組回腸與試驗(yàn)1 組盲腸大腸桿菌數(shù)量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。35 日齡時,試驗(yàn)1、2 組回腸、盲腸中大腸桿菌數(shù)量與空白對照組相比明顯減少(P<0.05)。中藥對照組不同日齡回腸、盲腸大腸桿菌數(shù)量與空白對照組及試驗(yàn)1、2 組相比,沒有明顯的差異(P>0.05)。

2.2 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道酶活性的影響 由表2 可知,在21 和35 日齡時,試驗(yàn)1、2 組與空白對照組相比,淀粉酶和蛋白酶活性明顯升高(P<0.05),在21 日齡,試驗(yàn)1 組淀粉酶活性明顯高于中藥對照組(P<0.05),中藥對照組淀粉酶活性明顯高于空白對照組(P<0.05)。35 日齡時,中藥對照組蛋白酶活性明顯高于空白對照組(P<0.05),與試驗(yàn)1、2 組相比,淀粉酶與蛋白酶活性有顯著性差異(P<0.05)。

表1 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道菌群數(shù)量的影響 (CFU/g)

表2 日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對肉雞腸道酶活性的影響 (U/g)

2.3 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道pH 值的影響 由表3 可知,肉雞腸道pH 值各組均有不同程度的下降,十二指腸的pH 值下降不顯著,各組間無顯著差異(P>0.05)。 在21 日齡時,試驗(yàn)2 組的空腸、回腸、盲腸pH 值下降最為明顯,與空白對照組相比差異顯著(P<0.05);在35日齡時,與空白對照組相比,試驗(yàn)組1、2 組空腸、回腸、盲腸pH 值明顯降低(P<0.05),而中藥對照組只有回腸pH 值與空白對照組差異顯著(P<0.05)。

表3 日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對肉雞腸道pH 值的影響

2.4 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道組織結(jié)構(gòu)的影響 從封二彩版圖1、圖2 可以看出,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2 組腸絨毛明顯變長,絨毛排列整齊、光滑,形態(tài)一致,單位面積上腸絨毛數(shù)量較多,而空白對照組和中藥對照組腸絨毛較寬,短而粗糙。

圖1 21 日齡肉雞回腸組織切片

圖2 35 日齡肉雞回腸組織切片

由表4 可知,21 日齡時,與空白對照組及中藥對照組相比較,試驗(yàn)1、2 組的腸絨毛長度顯著變長,隱窩深度變淺,腸壁厚度變薄(P<0.05);中藥對照組與空白對照組相比較沒有明顯差異(P>0.05)。35 日齡時,與空白對照組及中藥對照組相比較,試驗(yàn)1 的腸絨毛長度顯著增加,隱窩深度、腸壁厚度顯著降低(P<0.05);而試驗(yàn)2 組只有腸絨毛長度差異顯著(P<0.05)。

表4 日糧中添加復(fù)方中藥混菌發(fā)酵制劑對肉雞腸道組織結(jié)構(gòu)的影響 (μm)

3 討論

3.1 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道菌群數(shù)量的影響 腸道微生物菌群是消化系統(tǒng)的一個重要組成部分,乳酸桿菌和大腸桿菌常被作為研究畜禽腸道菌群的主要代表菌,其活菌含量與畜禽的健康密切相關(guān)[12]。董秀梅等研究表明,復(fù)方微生態(tài)制劑能使腸道中乳酸桿菌的數(shù)目明顯增多,并能明顯降低腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)目[13]。李樹鵬等研究表明,益生菌和黃芪多糖均能使腸道中的有益菌增殖,并阻抑有害菌的生長,兩者同時添加,作用增強(qiáng)[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在日糧中添加補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑,回腸、盲腸乳酸桿菌的數(shù)目顯著增加,而大腸桿菌的數(shù)目明顯下降。而未發(fā)酵的補(bǔ)中益氣湯制劑雖有一定的促進(jìn)乳酸桿菌增殖,抑制大腸桿菌繁殖的作用,但沒有發(fā)酵制劑明顯。因此,在日糧中添加一定劑量的補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑能夠調(diào)整肉雞腸道菌群,促進(jìn)有益菌的增殖,抑制有害菌繁殖。

3.2 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道酶活性的影響 腸道消化酶來源于腸道微生物、機(jī)體分泌及外界攝入,是生物機(jī)體腸道內(nèi)重要組成部分,參與腸道許多重要生物化學(xué)過程和物質(zhì)循環(huán),在機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、免疫和生長發(fā)育等方面具有重要作用[15]。張利娟等研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖和小檗堿的復(fù)合制劑能提高雞腸道淀粉酶和蛋白酶的活性[16]。王國霞等在蝦日糧中添加嗜酸性乳酸桿菌,發(fā)現(xiàn)能夠使蝦腸道內(nèi)淀粉酶和蛋白酶的活性明顯增高[17]。Jin 等試驗(yàn)表明,飼喂乳酸菌對肉雞小腸黏膜脂肪酶活性沒有明顯影響,能使淀粉酶的活性明顯增高[18]。但王志祥等在仔豬飼料里加入了乳酸桿菌,屠宰后仔豬十二指腸和胰腺內(nèi)脂肪酶和淀粉酶的活性明顯的提高[19]。張曉梅等在雛雞日糧中添加地衣芽孢桿菌和乳酸桿菌等混菌發(fā)酵,結(jié)果發(fā)現(xiàn)能明顯提高雛雞腸道內(nèi)脂肪酶和蛋白酶的活性[20]。前人研究發(fā)酵中藥對動物消化酶活性影響還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明,日糧中添加補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑可以顯著提高腸道淀粉酶和蛋白酶活性,而對脂肪酶活性影響不明顯。未發(fā)酵補(bǔ)中益氣湯制劑也有相似的作用。說明補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對促進(jìn)動物胃腸道興奮和消化腺分泌消化酶及提高飼料利用率等具有重要作用。這可能與補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑能有效地促進(jìn)小腸絨毛發(fā)育,增加消化吸收面積;調(diào)節(jié)腸道pH 值,為某些消化酶提供適宜的生化反應(yīng)條件;調(diào)節(jié)腸道菌群,使腸道外源酶增加、促進(jìn)內(nèi)源酶分泌及酶基因表達(dá)水平增強(qiáng)等原因有關(guān),從而使腸道酶活性提高。

3.3 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道pH 值的影響 腸道pH 值在動物對飼料養(yǎng)分消化、吸收和利用的過程中起著極其重要的作用,pH 值穩(wěn)定是保證動物腸道各類消化酶完成生物催化,維持消化道菌群動態(tài)平衡的一個重要因素[21]。 目前,添加物對畜禽腸道pH 值影響的研究上主要集中在微生態(tài)制劑和酸化劑上,多數(shù)研究表明,添加物可顯著降低腸道pH 值[22-23];中藥對腸道pH值的影響研究較少,多沒有明顯作用效果[21,24];關(guān)于發(fā)酵中藥對腸道pH 值的影響還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明,補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑能使肉雞空腸、回腸和盲腸pH 值顯著下降。腸道環(huán)境酸化,提高腸道酶活性,有利于日糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,有利于有益菌群的繁殖。

3.4 補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑對肉雞腸道組織結(jié)構(gòu)的影響 動物小腸黏膜絨毛高度、隱窩深度和腸壁厚度是評判腸道消化能力的重要指標(biāo)[25]。張金龍等研究結(jié)果表明,在飼料中添加2%發(fā)酵桑葉粉可顯著提升肉雞腸絨毛高度,增加了腸道隱窩深度[26]。邢亞麗等研究表明,在日糧中添加0.1%和0.2%樹舌發(fā)酵浸膏多糖可顯著增加肉雞腸絨毛高度,降低隱窩深度,提高腸絨毛高度和隱窩深度的比值[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑可顯著地增加肉雞腸絨毛長度,降低隱窩深度和腸壁厚度。說明補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑可明顯促進(jìn)小腸黏膜絨毛的生長發(fā)育,改善消化道黏膜形態(tài)與結(jié)構(gòu),進(jìn)而增加肉雞消化吸收能力。

4 結(jié)論

在肉雞飼料中添加補(bǔ)中益氣湯發(fā)酵制劑,能調(diào)節(jié)腸道菌群組成,增加腸道內(nèi)源酶活性,調(diào)節(jié)腸道pH 值,改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。