黃 新,吳桐忠,韓猛立,張星星,何延華,鐘發(fā)剛

(新疆農(nóng)墾科學(xué)院/省部共建新疆綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子832000)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬高死亡率為主要特征的一種急性、高度傳播性的腸道疾病。該病毒是冠狀病毒,其表面具有3 種結(jié)構(gòu)蛋白:纖突蛋白(S)、膜蛋白(M)、膜蛋白(E),其中S 蛋白在病毒吸附、融合等方面起到重要作用,同時(shí)也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要免疫蛋白。我國(guó)疫苗一直沿用歐洲經(jīng)典CV777 株,而我國(guó)PED 流行情況與歐洲差異較大,2010 年以來(lái),該病在我國(guó)大部分地區(qū)均有流行[1-2]。2013-2015 年期間,石河子市及周邊地區(qū)多個(gè)豬場(chǎng)出現(xiàn)2 周齡以?xún)?nèi)仔豬腹瀉死亡的群發(fā)病例,大多使用該疫苗免疫的豬群都沒(méi)有幸免PED 疫病。初步診斷由PED 引起[3]。研究表明,冠狀病毒S 基因的變化可以表現(xiàn)病毒的變異,為了弄清PED 病原流行變異情況,本研究對(duì)石河子地區(qū)的3 個(gè)流行PEDV 株分離鑒定,分別對(duì)其S 和ORF3 基因進(jìn)行克隆測(cè)序和序列分析比較,研究其遺傳變異規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 樣本為2013-2015 年樣品采集于石河子地區(qū)的146 團(tuán)、148 團(tuán)和沙灣三地的PED 檢測(cè)陽(yáng)性的仔豬脾臟和腸內(nèi)容物。置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與材料 RNA 提取試劑盒,購(gòu)自Invitrogen 公司的TRIZol;反轉(zhuǎn)錄(AMV)試劑盒、Taq DNA聚合酶(含10×Buffer)、dNTP,DL 5 000 bp DNA Marker、膠回收試劑盒、pMD18-T 連接試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;病毒基因組提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;大腸桿菌DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 豬流行性腹瀉病毒S 基因、ORF3 基因擴(kuò)增

1.3.1 擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒S 基因和ORF3 基因引物 根據(jù)GenBank PEDV S 基因相對(duì)保守序列分別設(shè)計(jì)3 條引物涵蓋了整個(gè)S 基因4.2 kb 的片段,引物分2 段進(jìn)行,分別擴(kuò)增S 基因的S1 和S2 片段;根據(jù)GenBank PEDV ORF3 基因相對(duì)保守序列設(shè)計(jì)3 條引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 RT-PCR 擴(kuò)增PEDV S 和ORF3 基因的引物序列

1.3.2 樣本的處理及病毒總RNA 的提取 取腸內(nèi)容物及腸系膜淋巴結(jié)(剪碎后,用液氮在研缽中研碎成粉狀),使用PBS 制成10%懸液,震蕩混勻,反復(fù)凍融3 次。6 000 r/min(4 ℃)離心10 min。取上清400 μL,使用TRIZol 法提取樣品中的總RNA。

1.3.3 PEDVS 基因擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄引物R1-ped-S1 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用已合成的cDNA 為模板,使用引物F1-ped-S1/R1-ped-S1 進(jìn)行PCR 第1 次擴(kuò)增,然后使用一擴(kuò)產(chǎn)物1 μL 分別使用引物F2-ped-S1/R1-ped-S1 進(jìn)行第2 次擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件如下:94 ℃變性5 min;94 ℃45 s,55 ℃45 s,72 ℃120 s 30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。兩次的反應(yīng)條件相同。反應(yīng)結(jié)束取第2 次擴(kuò)增的的PCR 產(chǎn)物5 μL,用8 g/L 的瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.4 PEDV ORF3 基因擴(kuò)增 以反轉(zhuǎn)錄引物R1-ped-orf3 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,用已合成的cDNA 為模板,使用引物F1-ped-orf3/ R1-ped-orf3 進(jìn)行PCR 第1 次擴(kuò)增,然后使用一擴(kuò)產(chǎn)物1 μL 分別使用引物F2-ped-orf3/R1-ped-orf3 進(jìn)行第2 次擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件如下:94 ℃變性5 min;94 ℃45 s,55 ℃45 s,72 ℃60 s 30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。兩次的反應(yīng)條件相同。反應(yīng)結(jié)束取第2 次擴(kuò)增的的PCR 產(chǎn)物5 μL,用15 g/L 的瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.4 序列分析 應(yīng)用DNAMAN 和DNAStar 等分析軟件對(duì)擴(kuò)增的S 和ORF3 基因序列進(jìn)行分析,并與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)表的PEDV S 和ORF3 基因序列進(jìn)行比較分析,繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析石河子地區(qū)PEDV 分離株與其他毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增PEDV S、ORF3 基因片段的結(jié)果 使用已檢測(cè)PEDV 為陽(yáng)性的樣本為RNA 為模板,反轉(zhuǎn)錄后使用引物F1-ped-S1/ R1-ped-S1 一擴(kuò),用其產(chǎn)物使用F2-ped-S1/ R1-ped-S1 進(jìn)行二擴(kuò);反轉(zhuǎn)錄后使用引物F1-ped-S2/ R1-ped-S2 一擴(kuò),用其產(chǎn)物使用F2-ped-S2/R1-ped-S2 進(jìn)行二擴(kuò)(圖1),獲得預(yù)期大小(2 104 bp、2 084 bp);擴(kuò)增ORF3 基因,反轉(zhuǎn)錄后使用引物F1-ped-orf3/R1-ped-orf3 一擴(kuò),用其產(chǎn)物使用F2-ped-orf3/ R1-ped-orf3 進(jìn)行二擴(kuò)PEDV 特異性片段,與預(yù)期結(jié)果一致(799 bp)。

圖1 擴(kuò)增PEDV S 基因、ORF3 基因片段

2.2 測(cè)序結(jié)果分析 PEDV S 基因測(cè)序結(jié)果表明,所測(cè)定的3 株P(guān)EDV XJ-SHZ148、XJ-SHZ146 和XJSW 的S 基因片段大小為4 161 bp、4 161 bp、4 170 bp;使用NCBI 在線Blast 程序(http://Blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)3 株基因序列進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),PEDV XJ-SHZ148、XJ-SHZ146 株與韓國(guó)QIAP1401 株(KX793713)序列相似性最高,達(dá)到97.4%和98.7%;XJ-SW 株與廣東GD-03 2012 株(KP870115)序列相似性最高,達(dá)到98.5%。 與PEDV 疫苗株AF353511(CV777)序列相似性分別為94.5%、94.2%和94.1%。序列分析表明,變異較大的區(qū)域在S 蛋白的S1 區(qū)域(1-735 aa),尤其在S1 片段的N 端點(diǎn)80~300 aa 差異較大。

2.3 根據(jù)PEDV S 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用MEGA6.0 軟件對(duì)PEDV XJ-SHZ148、XJ-SHZ146、XJSW 和GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的14 株P(guān)EDV S 基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析,以探討其間的遺傳進(jìn)化關(guān)系(見(jiàn)圖2)Bootstrap 值為1 000。所選用的這些毒株的參考序列來(lái)自不同國(guó)家、地域,它們代表著PEDV 不同群。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,該病毒已出現(xiàn)了與區(qū)域相關(guān)的多個(gè)基因分支,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)被分成3 個(gè)較大的拓?fù)浞种?(1)XJ-SHZ148 與我國(guó)浙江的ZJXS2013 株(KF468755)和遼寧CH LNC2014(KP399608)相近,XJ-SHZ146 與 韓 國(guó) 的 KPV1406(KM108353)、QIAP1401(KX793713) 及黑龍江HLJHH/2011 株(JQ638916)相 近,XJ-SW 與 廣 東 GD/03/2012(KP870115)相近,3 個(gè)小拓?fù)淙和瑸橐粋€(gè)大拓?fù)浞种?(2)中國(guó)的CH3 株和FJND/2011 株與歐洲的CV777 株同為一拓?fù)浞种?(3)廣西CH13/GX(JQ979288)株、CH22/JS(JQ979290)株、CH STC(KP399632)株、中國(guó)的福建CH9/FJ(JQ979287)株和江蘇南京NJ(KJ642641)株相近,為一個(gè)大拓?fù)浞种А?/p>

圖2 石河子分離株和14 株豬流行性腹瀉病毒S 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 根據(jù)PEDV ORF3 序列分析 PEDV ORF3 基因測(cè)序結(jié)果表明,所測(cè)定的3 株P(guān)EDV XJ-SHZ148、XJSHZ146 和XJ-SW 的ORF3 基因片段大小均為799 bp,序列相似性比較結(jié)果顯示,與已分離鑒定的歐洲代表毒株(CV777)相比,石河子分離株、大部分中國(guó)毒株和韓國(guó)毒株在PEDV ORF3 的G-55A、C-64T、T-163C、T-239G、C-394T、T-538C、T-547G 均存在突變,而在疫苗株(CV777)的對(duì)應(yīng)位置未發(fā)現(xiàn)這些突變。

結(jié)果發(fā)現(xiàn),PEDV XJ-SHZ148 株與浙江ZJ13XS0401株(KM213254)、HuB12 株(KU641659)、AHXZ 株(KU641670)、SH2015 株(KU641676)序列相似性最高,達(dá)到99.5%;XJ-SHZ146 株與湖南 HuN1210 株(KU641659)、HeB121(KU641668)序列相似性最高、HLJGQ 株(KU64167)、SH2015 株(KU641676),達(dá) 到100.0%;XJ-SW 株與廣東GDMM 株(KU641642)、湖南HuN1210 株(KU641659)、FJFZ(KU641669)等序列相似性最高,達(dá)到99.7%。與PEDV 疫苗株AF353511(CV777)序列相似性分別為55.2%、55.1%和54.7%(見(jiàn)圖2)。

3 討論

在豬場(chǎng),疫苗免疫始終是防控動(dòng)物傳染病的重要手段,但我國(guó)自2010 年以來(lái),豬流行性腹瀉疫苗的使用并沒(méi)有降低該病在各地的流行和暴發(fā)。追溯所用疫苗大多為CV777 毒株,該病毒為比利時(shí)(1977)分離株,被我國(guó)作為疫苗候選株沿用至今。免疫疫苗后仍然暴發(fā)PED 的情況頻發(fā)[4-7]。提示各地PED 流行毒株的主要抗原基因有發(fā)生變異的可能。纖突蛋白基因(S)是PEDV 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫性中和抗體的主要免疫蛋白[8],該蛋白的變異是導(dǎo)致免疫失敗的重要原因。本試驗(yàn)測(cè)定了石河子地區(qū)3 個(gè)PEDV S 基因的全序列,并對(duì)其進(jìn)行序列分析,對(duì)相關(guān)遺傳變異分析研究提供依據(jù)。

通過(guò)對(duì)所測(cè)定的3 株P(guān)EDV XJ-SHZ148、XJSHZ146 和XJ-SW 的S 基因序列在線BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn),PEDV XJ-SHZ148、XJ-SHZ146 株與韓國(guó)QIAP1401株(KX793713)序列相似性最高;XJ-SW 株與廣東GD-03 2012 株(KP870115)序列相似性最高。與PEDV 疫苗株AF353511(CV777)序列相似性較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析將XJ-SHZ148、XJ-SHZ146 株與韓國(guó)及我國(guó)的浙江、遼寧株為同一拓?fù)淙?。XJ-SW 株與廣東、黑龍江為同一拓?fù)淙?。與歐洲的CV777 株關(guān)系較遠(yuǎn)。表明我國(guó)PED 流行毒株較復(fù)雜,多個(gè)省市的流行既與韓國(guó)等周?chē)鷩?guó)家有較高的相似性,4 個(gè)群都有分布,但大多數(shù)PED 流行毒株與疫苗株(CV777)相似性不高,與國(guó)內(nèi)多個(gè)報(bào)道類(lèi)似[1-2,5,9-10]。

PEDV ORF3 基因序列分析表明,石河子地區(qū)分離毒株、我國(guó)多個(gè)地區(qū)分離毒株與疫苗毒株(CV777)相比,在ORF3 的多個(gè)位點(diǎn)存在突變,存在較大差異,與郭容利等報(bào)道一致[12-13]。

圖3 石河子分離株和18 株P(guān)EDV ORF3 基因核苷酸序列比對(duì)分析

PED 廣泛存在與流行已嚴(yán)重影響了各地養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)安全。PEDV 疫苗株與流行毒株存在較大變異以及后海穴注射方式不易操作的現(xiàn)實(shí),急需各地快速、準(zhǔn)確弄清當(dāng)?shù)豍EDV 流行毒株特征,研制相應(yīng)疫苗,應(yīng)對(duì)當(dāng)前變異株的流行。