王秀麗,張 媛,李紅霞,袁 露,李愛玲,曹翠萍,劉 博,辛凌翔,彭國(guó)瑞,李 建,蔣玉文

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀100081;2.齊魯動(dòng)物保健品有限公司,山東 濟(jì)南250100;3.遼寧益康生物股份有限公司,遼寧 遼陽111000)

1 材料與方法

1.1 參考疫苗

1.1.1 參考疫苗的制備 按照《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》[5]的方法,制備一批(500 瓶)仔豬副傷寒參考疫苗(20 頭份/瓶),置于-70 ℃以下保存,批號(hào):201602,對(duì)新制備的參考疫苗候選物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),作為保存期0 個(gè)月時(shí)每頭份參考疫苗的活菌數(shù)。

1.1.2 參考疫苗的分發(fā) 從500 瓶參考疫苗中隨機(jī)抽取100 瓶,置于隔熱泡沫塑料盒內(nèi),并放入生物冰袋,最外層包裝為紙箱,由EMS 快遞至A 單位、B單位和C 單位,收到樣品后立即置于-70 ℃以下冰箱中保存[6]。

1.2 培養(yǎng)基及耗材 普通瓊脂培養(yǎng)基,批號(hào):160412,普通肉湯培養(yǎng)基,批號(hào):160412,均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司;1 mL、10 mL 一次性吸管,購(gòu)自Costar 公司;一次性平皿(直徑90 mm),購(gòu)自青島金典生化器材公司。A、B、C 三家單位所用的試驗(yàn)耗材完全一致。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn) B 單位和C 單位分別從100 瓶參考疫苗中隨機(jī)抽取5 瓶用1.1.2 相同的方式寄到A 單位,A 單位檢驗(yàn)員收到樣品后馬上進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),運(yùn)輸過程均需要2 d,分析運(yùn)輸過程對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響。

1.3.2 均一性試驗(yàn) 隨機(jī)抽取500 瓶疫苗中的10瓶,由A 單位2 名檢驗(yàn)員,按照《中國(guó)獸藥典》2015年版進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),每瓶疫苗加入10 mL 普通肉湯溶解,混勻后取1.0 mL 加入9.0 mL 普通肉湯中稀釋,依次稀釋至10-7,取0.1 mL 10-7稀釋度的菌液滴3 付平板,0.1 mL/付,在普通瓊脂上鋪均,37 ℃培養(yǎng)24 h,記錄每瓶疫苗活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果,計(jì)算10瓶疫苗計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)。

1.3.3 協(xié)作標(biāo)定 分別隨機(jī)抽取100 瓶參考疫苗、100 瓶普通瓊脂(100 mL/瓶)、100 瓶普通肉湯培養(yǎng)基(200 mL/瓶)以及相關(guān)耗材寄給B 單位和C 單位,A、B、C 3 家單位分別隨機(jī)抽取2 名檢驗(yàn)員,每位檢驗(yàn)員對(duì)3 瓶參考疫苗按照1.3.1 的方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),每瓶疫苗進(jìn)行2 次活菌計(jì)數(shù)的重復(fù)性試驗(yàn),統(tǒng)計(jì)不同檢驗(yàn)員在不同時(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室活菌計(jì)數(shù)的結(jié)果[7]。

外高橋保稅區(qū)一經(jīng)設(shè)立，就是開放度最高、自由貿(mào)易的功能性最強(qiáng)的保稅區(qū)。當(dāng)時(shí)，國(guó)務(wù)院確定外交橋保稅區(qū)內(nèi)：一是實(shí)行免關(guān)稅、免許可證；二是允許外商貿(mào)易機(jī)構(gòu)從事轉(zhuǎn)口貿(mào)易；三是可為區(qū)內(nèi)外商投資企業(yè)代理本企業(yè)生產(chǎn)用原材料、零配件進(jìn)口和產(chǎn)品出口業(yè)務(wù)；四是區(qū)內(nèi)企業(yè)外匯全額留成；五是各國(guó)貨幣流通；六是設(shè)立生產(chǎn)資料交易中心；七是對(duì)保稅區(qū)內(nèi)的主要經(jīng)營(yíng)管理人員可辦理多次出入境護(hù)照，提供出入境方便。

1.3.4 保存期試驗(yàn) 按照協(xié)作標(biāo)定的方法對(duì)保存5~18 個(gè)月的仔豬副傷寒活菌計(jì)數(shù)參考疫苗進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),剔除每次試驗(yàn)不滿意的數(shù)值,統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的中位數(shù)、平均數(shù)、變異系數(shù),判定參考疫苗在18 個(gè)月內(nèi)菌數(shù)的差異。

1.4 結(jié)果處理

1.4.1 均一性試驗(yàn) 10 瓶參考疫苗活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)小于10%,說明疫苗瓶間差異不顯著,均一性良好。

1.4.2 根據(jù)CNAS-GL02:2006 《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[8]中穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法,測(cè)定Z 比分值,用于分析每個(gè)計(jì)數(shù)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果中所處的位置。 Z 比分值采用X、XM、Norm IQR 來確定[9]。

Z 比分值計(jì)算公式:Z=(X-XM)/Norm IQR

式中:Z 為穩(wěn)健比分值;X 為檢驗(yàn)數(shù)據(jù);XM 為中位值;Norm IQR 為標(biāo)準(zhǔn)化四分位距,Norm IQR=0.741 3×四分位間距(IQR)。

判定標(biāo)準(zhǔn)為:︱Z︱≤2 為滿意結(jié)果;2<︱Z︱<3 時(shí),表示結(jié)果可疑;︱Z︱≥3 為不滿意結(jié)果。

1.4.3 出現(xiàn)以下情況之一者,檢驗(yàn)結(jié)果判為“不滿意”,并將檢驗(yàn)數(shù)據(jù)剔除,不參與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):(1)任一平板上菌落數(shù)小于40 或大于200;(2)平板上有片狀菌落生長(zhǎng);(3)3 付平板間菌落數(shù)相差50%以上[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn) 由A 單位2 名檢驗(yàn)員對(duì)B單位和C 單位分別寄回的5 瓶參考疫苗候選物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),結(jié)果顯示,2 名檢驗(yàn)員對(duì)10 瓶參考疫苗計(jì)數(shù)結(jié)果的最大差異為5%,差異不明顯,10 瓶參考疫苗計(jì)數(shù)結(jié)果的最小值為3.6×109CFU/頭份,本參考疫苗保存期為0 個(gè)月的計(jì)數(shù)結(jié)果為3.5×109CFU/頭份,結(jié)果一致,說明該參考疫苗在2 ℃~10 ℃運(yùn)輸,48 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好,具體結(jié)果見表1。

2.2 樣品的均一性分析 檢驗(yàn)員1 計(jì)數(shù)結(jié)果的中位數(shù)為4.0×109.0CFU/頭份,上四分位數(shù)為4.2×109.0CFU/頭份,下四分位數(shù)為3.6×109.0CFU/頭份,標(biāo)準(zhǔn)化四分位居為0.518 9,變異系數(shù)8.4%;檢驗(yàn)員2 計(jì)數(shù)結(jié)果的中位數(shù)為4.05×109.0CFU/頭份,上四分位數(shù)為4.3×109.0CFU/頭份,下四分位數(shù)為3.6×109.0CFU/頭份,標(biāo)準(zhǔn)化四分位居為0.518 9,變異系數(shù)8.2%。檢驗(yàn)員1 和檢驗(yàn)員2 計(jì)數(shù)的結(jié)果差異在5.3%以內(nèi),在活菌計(jì)數(shù)的誤差范圍內(nèi),︱Z︱均小于2,結(jié)果滿意,見表2。

表1 運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表2 均一性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 協(xié)作標(biāo)定 A、B、C 3 家單位6 名檢驗(yàn)員對(duì)18 瓶參考疫苗計(jì)數(shù)的結(jié)果為(×109.0CFU):3.0、3.2、3.2、3.3、3.7、3.8、3.4、3.6、3.6、3.4、3.7、3.8、3.4、3.4、3.8、3.6、3.7、3.5、3.2、3.3、3.4、3.6、3.7、3.6、3.4、3.2、3.6、3.5、4.2、3.9、4.2、4.0、3.5、3.2、3.3、3.3,剔除不滿意結(jié)果(︱Z︱>2 的數(shù)據(jù)),對(duì)剩余的34 個(gè)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值為3.5,中位數(shù)為3.5,變異系數(shù)為6.7%,結(jié)果滿意,且計(jì)數(shù)結(jié)果的平均數(shù)與保存期為0 個(gè)月計(jì)數(shù)結(jié)果一致(保存期為0 個(gè)月時(shí)的計(jì)數(shù)結(jié)果為3.5×109CFU/頭份)。

2.4 保存期試驗(yàn) 按照協(xié)作標(biāo)定的方法對(duì)-70 ℃以下保存5 ~18 個(gè)月的仔豬副傷寒參考疫苗候選物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),剔除結(jié)果不滿意的偏離數(shù)據(jù),變異系數(shù)為6.7%~8.9%,均小于10%,平均數(shù)為3.4×109~3.7×109CFU/頭份,中位數(shù)為3.4×109~3.75×109CFU/頭份,均在活菌計(jì)數(shù)可接受的誤差范圍內(nèi),且活菌計(jì)數(shù)結(jié)果在18 月內(nèi)未隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,結(jié)果見表3。

3 討論與小結(jié)

活菌數(shù)是直接關(guān)系到獸用細(xì)菌類活疫苗安全性和免疫效力的重要參數(shù),是疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵之一,在細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室工作中,可靠的計(jì)數(shù)結(jié)果是準(zhǔn)確判斷細(xì)菌毒力及免疫原性的前提。

運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示,參考疫苗候選物在2 ℃~10 ℃冷藏條件下運(yùn)輸48 h,活菌數(shù)未因溫度不恒定或者運(yùn)輸過程的條件差異而下降,說明運(yùn)輸穩(wěn)定性良好?；诖?均一性試驗(yàn)和協(xié)作標(biāo)定及保存期試驗(yàn)才有意義。這也為將來參考疫苗應(yīng)用過程中樣品的發(fā)放不會(huì)受到運(yùn)輸過程的影響提供數(shù)據(jù)支撐。

均一性試驗(yàn)結(jié)果顯示,隨機(jī)抽取的10 瓶樣品計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)小于10%,證明本批次樣品的均一性良好。

表3 保存期5~18 個(gè)月活菌計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì) (×109CFU/頭份)

因活菌計(jì)數(shù)結(jié)果受諸多因素影響,如培養(yǎng)基質(zhì)量、操作方法、培養(yǎng)條件、稀釋液、操作溫度、菌液沖擊程度、平板濕度等。 在本研究中,仔豬副傷寒(C500 株)參考疫苗候選物為同一批次的樣品,培養(yǎng)基和稀釋液均由同一單位發(fā)放,導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果差異的樣品、培養(yǎng)基、稀釋液的影響因素不存在,影響因素可能有兩方面,一是稀釋過程中菌液沖擊的程度不一致;二是所使用普通瓊脂平板表面的濕度不一致。盡管按照統(tǒng)一的操作規(guī)程進(jìn)行操作,活菌數(shù)也有差異,同一檢驗(yàn)員對(duì)同一份樣品進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果相差10%均在可接受的范圍內(nèi)。在協(xié)作標(biāo)定中,3 家單位的計(jì)數(shù)結(jié)果也有差異,C 單位計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)偏高,這與每家單位的計(jì)數(shù)操作習(xí)慣及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境有關(guān)系。這也是參考品和國(guó)家/國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品需要協(xié)作標(biāo)定的原因,本次協(xié)作標(biāo)定結(jié)果滿意,且平均數(shù)與保存期為0 個(gè)月時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果一致。

作為活菌計(jì)數(shù)的參考疫苗,在一定的保存期內(nèi)活菌數(shù)穩(wěn)定是前提條件,本研究對(duì)保存18 個(gè)月內(nèi)的參考疫苗候選物每月均用協(xié)作標(biāo)定的方法計(jì)數(shù),結(jié)果表明,在18 個(gè)月的保存期內(nèi),計(jì)數(shù)結(jié)果未隨時(shí)間的推移而降低,說明參考疫苗在18 個(gè)月內(nèi)活菌數(shù)穩(wěn)定,本研究可以為仔豬副傷寒活菌計(jì)數(shù)參考疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可靠依據(jù)。