李修陽　張寧　任健　徐琬梨　李毓秋　陳宇

摘要：目的 ?探索針刺對多囊卵巢綜合征（PCOS）痰濕證患者血清代謝組分影響的作用機(jī)制。方法 ?采用隨機(jī)數(shù)字表法將PCOS痰濕證患者分為針刺組和西藥組各20例。針刺組予針灸治療，每日1次，周末及經(jīng)期暫停;西藥組予炔雌醇環(huán)丙孕酮片，每日1片，口服，自月經(jīng)來潮或撤退性出血第5日起連續(xù)治療21 d。2組均連續(xù)治療3個月。觀察2組治療前后卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）水平，比較LH/FSH、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）;檢測2組治療前后血清內(nèi)源性小分子代謝物，比較2組代謝圖譜差異，分析針刺對患者血清小分子代謝物的影響，確定其與人體生化代謝通路異常的內(nèi)在聯(lián)系。結(jié)果 ?與本組治療前比較，2組治療后FSH、LH、T、LH/FSH、BMI明顯改善（P<0.05）;2組治療后比較，針刺組BMI優(yōu)于西藥組（P<0.05）。2組均對酮類合成降解、生物素代謝、賴氨酸合成降解等代謝通路產(chǎn)生影響，針刺組對PCOS痰濕證生物標(biāo)志物檸檬酸及其上游糖代謝相關(guān)小分子代謝物所在通路影響更為顯著。結(jié)論 ?針刺可能通過影響檸檬酸循環(huán)改善糖酵解和糖異生，恢復(fù)PCOS痰濕證患者的能量代謝。

關(guān)鍵詞：針刺;多囊卵巢綜合征;血清;代謝組分;機(jī)制研究

中圖分類號：R271.917.51 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0015-05

Study on?Mechanism of Effects of Acupuncture on Serum Metabolic Components of Phlegm-dampness Type of Polycystic Ovary Syndrome

LI Xiuyang¹， ZHANG Ning²， REN Jian¹， XU Wanli¹， LI Yuqiu¹， CHEN Yu¹

1. Shandong University of TCM， Jinan 250355， China;2. Affiliated Hospital of Shandong University of TCM， Jinan 250011， China

Abstract： Objective?To explore the mechanism of acupuncture on serum metabolic components of phlegm-dampness type of polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods?Patients with phlegm-dampness type of PCOS were divided into acupuncture group and Western medicine group according to random number table method， with 20 patients in each group. Acupuncture group was treated with acupuncture， once a day， resting during weekends and menstrual periods; Western medicine group was treated with ethinylestradiol cyproterone tablets， one tablet a day， orally， taking 21 days from the 5th day of menstrual cramps （or withdrawal bleeding）. Treatment for both groups lasted for three months. The levels of follicle stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and testosterone （T） were observed before and after treatment. The LH/FSH and body mass index （BMI） were compared.?The serum endogenous small molecule metabolites of the two groups were detected before and after treatment. The differences of metabolic profiles were compared. The effects of acupuncture on serum small molecule metabolites were analyzed to determine its intrinsic link with abnormalities of human biochemical metabolic pathways. Results?Compared with before treatment， the FSH， LH， T， LH/FSH and BMI of the two groups were significantly improved （P<0.05）.?After treatment， BMI in the acupuncture group was better than that in the Western medicine group （P<0.05）. Both groups had effects on metabolic pathways such as ketone synthesis degradation， biotin metabolism，lysine synthesis and degradation. But acupuncture group had a more significant effect on the pathway of biomarker citric acid of phlegm-dampness type of PCOS and its upstream sugar metabolism-related small molecule metabolites. Conclusion?Acupuncture may improve glycolysis and gluconeogenesis by affecting the citric acid cycle， and restore the energy metabolism of phlegm-dampness type of PCOS.

Keywords： acupuncture; polycystic ovary syndrome; serum; metabolic components; mechanism study

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育齡期女性最為多見的內(nèi)分泌紊亂疾病，是引發(fā)不排卵性不孕的主要因素，在不排卵性不孕中的發(fā)病率為50%～70%^[1]。西醫(yī)治療本病主要采用激素對抗療法，促排卵藥糾正不排卵和多囊樣改變，但易引發(fā)卵巢過度刺激征、子宮內(nèi)膜增生等不良反應(yīng)^[2]。針刺療法可明顯改善PCOS患者內(nèi)分泌異常和排卵障礙^[3]，但作用機(jī)制復(fù)雜。本課題組前期篩選出PCOS痰濕證常見的9種血清生物標(biāo)志物^[4]。本研究通過對比針刺與常規(guī)西藥對患者血清常見生物標(biāo)志物的影響，闡釋針刺治療PCOS可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 ?資料與方法

1.1 ?一般資料

選擇2017年10月-2018年8月山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心的住院與門診患者40例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為針刺組和西藥組各20例。針刺組平均年齡（32.25±1.66）歲，平均病程（4.12±1.19）年;西藥組平均年齡（29.94±2.92）歲，平均病程（3.98±1.32）年。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)[（2017）臨床科研申報第（048）號]。

1.2 ?西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會與歐洲人類生殖協(xié)會共同認(rèn)定的鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)^[5]制定PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)。①偶發(fā)排卵和/或無排卵;②臨床和/或生化指標(biāo)提示存在高雄激素血癥（HA），并排除先天性腎上腺增生、分泌雄激素腫瘤和庫欣綜合征等。HA臨床表現(xiàn)為痤瘡、多毛、禿頂，生化指標(biāo)強(qiáng)調(diào)游離睪酮的意義;③雙側(cè)卵巢多囊性改變：雙側(cè)卵巢見12個及以上直徑2～9 mm小卵泡，和/或單側(cè)卵巢體積>10 cm³。以上①～③項(xiàng)具備任意2項(xiàng)即可診斷。

1.3 ?中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》^[6]、《中醫(yī)婦科學(xué)》^[7]制定痰濕證辨證標(biāo)準(zhǔn)。①周期延后，經(jīng)量少，經(jīng)色淡紅，質(zhì)黏膩如痰，或逐漸閉經(jīng)，或婚久不孕;②胸腹痞滿;③易惡心嘔吐;④形體肥胖或四肢倦怠，神疲乏力;⑤白帶多而黏膩;⑥舌淡胖或有齒印，苔膩;⑦脈滑。以上①必備，兼見其余3項(xiàng)即可辨證。

1.4 ?納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);②近3個月未服用可能對生殖內(nèi)分泌及代謝功能有影響的藥物;③患者對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.5 ?排除標(biāo)準(zhǔn)

①伴內(nèi)分泌功能異常，如腎上腺皮質(zhì)增生癥、腎上腺皮質(zhì)功能減退、甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能低下、垂體腫瘤、糖尿病;②伴肝、腎、心腦血管系統(tǒng)疾病者;③伴血液病、急性生殖泌尿系統(tǒng)炎癥及神經(jīng)、精神性疾病者;④生殖器官器質(zhì)性病變、生殖系統(tǒng)腫瘤者;⑤近3個月內(nèi)服用激素類藥物或避孕藥者;⑥生理性月經(jīng)后期及閉經(jīng)者;⑦依從性較差者。

1.6 ?治療方法

針刺組：取三陰交、關(guān)元、子宮、中極、氣海、陰陵泉、豐隆、腎俞、太溪，除氣海、關(guān)元、中極外均取雙側(cè)，陰陵泉、三陰交、豐隆先瀉后補(bǔ)^[8-9]，每日1次，留針30 min，10 min行針1次，每周5次，周末和經(jīng)期暫停。西藥組予炔雌醇環(huán)丙孕酮片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號280A，2?mg∶0.035?mg/片），每日1片，口服，自月經(jīng)來潮或撤退性出血第5日起連續(xù)服用21 d。2組均治療3個月。

1.7 ?觀察指標(biāo)

1.7.1 ?激素水平及體質(zhì)量指數(shù)

于治療前后2組患者早卵泡期（月經(jīng)3～4 d）或閉經(jīng)期（B超下無優(yōu)勢卵泡）抽取空腹靜脈血5?mL，3000 r/min離心10 min取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。檢測2組患者卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）水平，比較LH/FSH。測量患者體質(zhì)量、身高，計算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。

1.7.2 ?代謝組學(xué)標(biāo)本檢測

檢測分為NMR數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理和代謝物的篩選與鑒定三部分。數(shù)據(jù)處理采用無監(jiān)督的模式識別方法和有監(jiān)督的模式識別方法結(jié)合方式，無監(jiān)督模式識別方法采用主成分分析法（PCA），有監(jiān)督模式識別方法引入正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），將正交信號校正法（OSC）與偏最小二乘法（PLS）結(jié)合，以提高模式識別方法的判斷能力。通過OPLS-DA和各代謝物相對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，篩選出有統(tǒng)計意義的差異代謝物，通過差異代謝物映射的通路，找到與代謝物差異相關(guān)性最高的代謝通路。

2 ?結(jié)果

2.1 ?2組治療前后激素水平、體質(zhì)量指數(shù)比較

與本組治療前比較，2組治療后T、LH、FSH水平及LH/FSH、BMI明顯改善（P<0.05）。2組治療后比較，西藥組T、LH、FSH水平及LH/FSH優(yōu)于針刺組（P<0.05），針刺組BMI指數(shù)優(yōu)于西藥組（P<0.05），見表1。

2.2 ?主成分分析

PCA是將一組觀測的可能相關(guān)變量，通過正交變換轉(zhuǎn)換為線性不相關(guān)變量（即主成分）的統(tǒng)計方法，可揭示數(shù)據(jù)內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好地解釋數(shù)據(jù)變量，有效地利用少量的主成分使數(shù)據(jù)的維度降低。針刺組和西藥組血清樣本PCA得分散點(diǎn)圖見圖1、圖2?？梢娭委熐昂?組代謝成分可顯著分開，說明2組治療均會導(dǎo)致樣本代謝物水平發(fā)生一定程度變化。

2.3 ?2組治療前后代謝物正交偏最小二乘法-判別分析及模型驗(yàn)證結(jié)果

基于核磁共振平臺代謝組學(xué)數(shù)據(jù)具有較高維（檢測出一些代謝物）、小樣本（檢測樣本量偏少）的特性，若采用PCA模型或PLS模型分析，由于相關(guān)變量的影響，差異變量會分散到更多的主成分上，無法進(jìn)行更好的可視化和后續(xù)分析，故采用OPLS-DA，篩掉代謝物中與分類變量無關(guān)的正交變量，分別分析非正交變量和正交變量，得出更可靠的差異代謝物及相關(guān)程度信息。使用SIMCA-P+11.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行UV格式化處理，先對主成分行OPLS-DA建模分析，模型質(zhì)量用7折血清交叉驗(yàn)證檢驗(yàn);再用交叉驗(yàn)證后得出的R2Y（Y變量的可解釋變量）和Q2（可預(yù)測性）對模型有效性進(jìn)行評價;最后應(yīng)用置換檢驗(yàn)，多次隨機(jī)變換變量Y的排序得出不一樣的隨機(jī)Q2值，對其有效性做出較好查驗(yàn)。見圖3、圖4。從2組OPLS-DA散點(diǎn)圖可見，治療前后樣本可進(jìn)一步區(qū)分開。同時，下方的置換檢驗(yàn)圖中兩條虛線斜率均大于0，說明2組OPLS-DA模型擬合情況較好，不存在過擬合現(xiàn)象，穩(wěn)定性強(qiáng)，可較好地用于后續(xù)結(jié)果預(yù)測。

2.4 ?2組治療前后差異代謝物載荷圖及其相關(guān)代謝通路

對2組治療前后OPLS-DA及各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分析。將每一個變量的Loading值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根值相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)回溯轉(zhuǎn)換。與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進(jìn)行比對，得到引起治療前后差異的代謝物，并在載荷圖中重點(diǎn)標(biāo)注。結(jié)果顯示，2組治療前后血清代謝成分差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。針刺組治療后呈明顯上調(diào)趨勢的代謝物有檸檬酸、3-羥基丁酸、甘油磷酸膽堿、低密度脂蛋白L1、極低密度脂蛋白L2、脂質(zhì)L6、脂質(zhì)L9、α-葡萄糖、β-葡萄糖、賴氨酸、蘇氨酸。西藥組治療后呈顯著上調(diào)趨勢的代謝物有3-羥基丁酸、低密度脂蛋白L3、脂質(zhì)L8、脂質(zhì)L9、賴氨酸。見圖5、圖6。

通過對差異代謝物所在通路的綜合分析（包括富集分析和拓?fù)浞治觯┖秃Y選，找到與代謝物差異相關(guān)性最高的關(guān)鍵通路。其中，與2組均相關(guān)的代謝通路有酮類合成降解通路、生物素代謝、賴氨酸合成降解通路、氨?；?tRNA生物合成等，但針刺區(qū)別于西藥的差異代謝通路主要表現(xiàn)為檸檬酸循環(huán)通路和糖酵解、糖異生通路，改變的代謝物主要集中在檸檬酸循環(huán)的上游。代謝通路分析的結(jié)果見圖7、圖8。

3 ?討論

PCOS屬中醫(yī)學(xué)“閉經(jīng)”“不孕”等范疇。其發(fā)病與脾、肝、腎三臟功能失調(diào)關(guān)系密切，痰濕證是最常見證型，痰壅胞宮是PCOS基本病機(jī)^[10]。痰濕屬陰邪，易傷陽氣，痰濕停聚阻滯經(jīng)絡(luò)氣血正常運(yùn)行，使胞宮正常功能受到影響，能量代謝功能紊亂，最終導(dǎo)致月經(jīng)失調(diào)，難以受精成孕。國外研究顯示，PCOS患者存在檸檬酸循環(huán)障礙^[11]。檸檬酸循環(huán)是人體能量代謝的樞紐，其循環(huán)障礙會導(dǎo)致能量代謝紊亂，可伴隨出現(xiàn)多種機(jī)體供能不足的表現(xiàn)，這些表現(xiàn)與痰濕證表現(xiàn)基本一致。PCOS痰濕證患者體內(nèi)伴隨檸檬酸循環(huán)障礙，HA可通過減少檸檬酸水平影響檸檬酸循環(huán)，這也是胰島素抵抗存在的重要證據(jù)^[12]。研究發(fā)現(xiàn)，外源性補(bǔ)充檸檬酸能夠調(diào)節(jié)高脂血癥小鼠的血脂水平，并能改善高脂血癥小鼠對胰島素的敏感性^[13]。

針灸治療PCOS主要在于調(diào)整人體的內(nèi)分泌狀態(tài)，促使性激素的分泌和排卵功能恢復(fù)正常。三陰交為足三陰經(jīng)交會穴，可理血調(diào)經(jīng)、健脾攝血、補(bǔ)肝益腎;陰陵泉為脾經(jīng)合穴、治濕要穴，兩穴合用能治水濕諸證。豐隆為祛痰要穴，是胃經(jīng)絡(luò)穴，與脾經(jīng)穴位合用，共奏健脾和胃、燥濕化痰之功。太溪為腎經(jīng)原穴，與腎俞合用，可益氣填精，恢復(fù)腎陽的氣化作用，調(diào)節(jié)水濕代謝，恢復(fù)月經(jīng)。氣海、關(guān)元、中極為任脈要穴，能健運(yùn)中焦、固腎培元，三穴合用可增強(qiáng)元?dú)猓ㄕ{(diào)水道。子宮為經(jīng)外奇穴，主治月經(jīng)不調(diào)，痰濕壅滯。上述諸穴并用，可調(diào)節(jié)人體氣血陰陽平衡，運(yùn)化痰濕，恢復(fù)人體的正常能量代謝。本研究顯示，針刺改善患者內(nèi)分泌激素效果不如西藥顯著，但改善BMI優(yōu)勢明顯，這可能與針刺改善痰濕狀態(tài)、調(diào)節(jié)能量代謝有關(guān)。針刺和西藥均能顯著改變PCOS痰濕證的血清代謝組分，主要涉及的代謝通路也多有重合。本研究顯示，檸檬酸在針刺影響下顯著改變，提示針刺可通過改善人體能量代謝紊亂，調(diào)整人體的內(nèi)分泌機(jī)能。同時，針刺能明顯上調(diào)血清中葡萄糖及生糖氨基酸蘇氨酸水平，說明針刺對PCOS痰濕證的糖酵解增強(qiáng)和糖異生抑制狀態(tài)起到良性調(diào)節(jié)作用。作為膽堿酯酶抑制劑，甘油磷酸膽堿活性抑制后可使乙酰膽堿與其受體結(jié)合，誘導(dǎo)胰島素分泌，加重胰島素抵抗，血清中甘油磷酸膽堿在針刺后上調(diào)，說明針刺可能通過增強(qiáng)甘油磷酸膽堿活性，加快乙酰膽堿的代謝速率，以減輕高胰島素血癥。

綜上所述，本研究顯示針刺可能通過影響檸檬酸循環(huán)及上游小分子代謝物來改善糖酵解和糖異生，降低胰島素抵抗，恢復(fù)PCOS患者能量代謝。這可能是針刺區(qū)別于西藥治療的作用機(jī)制，也可能是針刺整體改善PCOS痰濕證患者代謝指標(biāo)的依據(jù)。今后將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步篩選關(guān)鍵的差異代謝物，從分子水平上明確針刺治療干預(yù)PCOS痰濕證的作用機(jī)制。

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