覃雙來，關(guān)江鋒，吳永貴，張秋

0 引言

疼痛是中晚期癌癥患者的主要并發(fā)癥，有研究報道，癌痛的發(fā)生率高達70%以上[1]，嚴重影響患者的生存質(zhì)量，甚至成為患者求醫(yī)的主要原因。由于疼痛產(chǎn)生的不良刺激和體驗，癌痛患者普遍存在抑郁狀態(tài)，其抑郁情緒發(fā)生率高達86.7%[2]，臨床多表現(xiàn)為情緒低落、興趣缺乏、疲乏、睡眠障礙等。已有研究證實了疼痛與抑郁之間存在相關(guān)性[3-4]，抑郁的發(fā)生及程度與疼痛的有無、分級呈正相關(guān)，疼痛是癌癥患者產(chǎn)生抑郁的主要因素[5]。癌痛和抑郁是互相影響的，癌痛可引起抑郁，抑郁又會加重患者對疼痛的感知和體驗，從而使患者陷入癌痛-抑郁的惡性循環(huán)，生存質(zhì)量嚴重降低，甚至導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、惡化等[6-7]。因此，識別及治療并發(fā)抑郁的癌痛患者，逐漸成為臨床醫(yī)生需要解決的迫切任務(wù)。

通過電針聯(lián)合疼痛貼對骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用實驗，發(fā)現(xiàn)脛骨癌痛模型大鼠伴隨有神情呆滯、活動度降低、飲食減少、毛發(fā)干枯等抑郁樣行為，考慮該模型存在抑郁樣改變，而針刺和疼痛貼具有較好的急慢性鎮(zhèn)痛作用，可能會緩解疼痛對脛骨癌痛模型大鼠產(chǎn)生抗的抑郁作用。本研究采用曠場實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗觀察脛骨癌痛模型大鼠行為學(xué)的改變，并從氧化應(yīng)激的角度探索其機制，為臨床上推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物來源

雄性SPF級SD大鼠（180～200 g）及幼鼠（60～80 g），實驗動物及飼料均購于湖北省實驗動物研究中心，許可證號SCXK（鄂）2015-0018。于湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥實驗中心（實驗動物中心）飼養(yǎng)，許可證號SYXK（鄂）2012-0067。室溫18℃～20℃，相對濕度50%～60%，12 h晝夜循環(huán)燈照，動物自由進食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后進行造模。所有實驗動物的處置均符合科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 試劑與材料

G A P D H抗體（s c-3 2 2 3 3）、B c l-2（sc-23960）、Caspase-3抗體（sc-373730）購自美國Santa Cruz公司，NE（N-069）、DA（H8502）和5-HT（25003）購自美國Sigma公司。Walker-256乳腺癌細胞購自武漢大學(xué)生物中心。丙二醛測定試劑盒、過氧化氫酶測定試劑盒（S0131）、HRP二抗、PVDF膜、甲醇、ECL、10%水合氯醛購自中國武漢谷歌生物公司。曠場實驗分析系統(tǒng)（JLBehv-LA，上海吉量），Triple Quad 6420TMLC/MS/MS系統(tǒng)（Agilent Technologies, 美國），韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（LH202H，中國，HANS），電泳儀（Powerpac HC，美國Bio-Rad），多色熒光凝膠成像系統(tǒng)（Universal HoodⅢ，美國Bio-Rad）。疼痛貼由川烏、草烏、延胡索、馬錢子、徐長卿、乳香、沒藥、土鱉蟲、蟾酥、冰片及薄荷腦等中藥材碾粉，按照一定比例混合基質(zhì)（100 g藥粉加入甘油30 g，乳化劑8 g，單甘脂20 g，羊毛脂20 g，凡士林40 g）后制成藥膏，由武漢市第一醫(yī)院制劑中心提供。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 Walker-256乳腺癌細胞注射至幼鼠腹腔（4×107cells/ml），接種7天后收集癌性腹水，離心3 min（1 300 r/min），沉淀后，用10 ml PBS洗滌，再次離心沉淀，然后以PBS重懸計數(shù)，調(diào)整至適當濃度（4×106cells/ml），置于冰盒內(nèi)備用。對大鼠進行適應(yīng)性刺激，篩選出連續(xù)3天的機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold, MWT）≥26 g的大鼠，參照Medhurst的方法[8]建立脛骨癌痛模型。腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺上，右側(cè)膝關(guān)節(jié)部位備皮，碘伏消毒皮膚。在無菌條件下，左手固定膝關(guān)節(jié)使其表面皮膚緊張，用7號針頭在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠端鉆孔，深約1 cm。然后用微量進樣器往脛骨骨髓腔內(nèi)注入4 μl腫瘤細胞，最后推入2 μl凝膠海綿溶液封口。另有大鼠12只，注射等量PBS后推入2 μl凝膠海綿溶液封口，作為空白組。所有試劑注射后均留針1 min，防止注射物滲出。術(shù)后9～13天MWT持續(xù)≤8 g的大鼠視為造模成功，成模率約為50%。建立大鼠脛骨癌痛模型，挑選表現(xiàn)有神情呆滯、活動度降低、飲食減少、毛發(fā)干枯等抑郁樣行為的大鼠48只，隨機分為四組：模型組、電針治療組（電針組）、疼痛貼治療組（疼痛貼組）、電針聯(lián)合疼痛貼治療組（聯(lián)合治療組），各組分籠飼養(yǎng)，做進一步實驗。

1.3.2 干預(yù)方法 空白組與模型組正常飼養(yǎng)，無特殊干預(yù)。電針組：按照《實驗針灸學(xué)》定位，將大鼠軀干固定于布制的柔軟鼠套中，露出頭部，待大鼠安靜后用碘伏消毒，“百會”穴向后頭部平刺進針，“印堂”穴向鼻尖平刺進針，用0.25 mm×13 mm針灸針直刺5～10 mm接電針，通過韓氏穴位神經(jīng)刺激儀給予“疏密波”，電針頻率為2 Hz/100 Hz，刺激強度為0.5～1.5 mA，以穴位局部出現(xiàn)皮膚肌肉輕微顫動為宜，持續(xù)30 min。疼痛貼組：在大鼠背部對稱兩側(cè)脫毛處皮膚上敷貼疼痛貼，6 h后去除藥物。聯(lián)合組：電針治療并貼敷疼痛貼。各組自造模成功后第3天起，每天干預(yù)1次，連續(xù)12天，干預(yù)完成后30 min內(nèi)完成指標測定。

1.3.3 取材方法 造模后12天完成相關(guān)測定后處死大鼠，取出大腦眶額葉，液氮凍存一周后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱凍存。

1.3.4 曠場實驗 實驗箱為80 cm×80 cm×80 cm的方形玻璃盒子。清潔實驗箱后，將其放在與計算機上曠場實驗分析軟件相連的隔音箱中。將大鼠放在實驗箱中央觀察15 min，記錄大鼠自由活動，應(yīng)用動物行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)跟蹤記錄5 min，分析大鼠的活動總路程。

1.3.5 懸尾實驗（TST） 將大鼠尾部固定后使大鼠頭部距離底面約5 cm，適應(yīng)2 min后以攝像機進行記錄大鼠的不動時間。計算2～6 min大鼠的無肢體掙扎的不動時間總和。

1.3.6 強迫游泳實驗（FST） 強迫游泳實驗在直徑23 cm高60 cm裝滿一半水的測試桶中進行。實驗前大鼠禁食不禁水12 h。在造模前1天進行預(yù)實驗，大鼠強迫游泳15 min后回籠, 在造模第12天進行正式實驗：記錄5 min內(nèi)大鼠在水中停止掙扎、呈漂浮狀態(tài)，或僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面的不動時間。

1.3.7 HPLC檢測眶額葉單胺類神經(jīng)遞質(zhì) 取凍存的眶額葉組織50 mg，加入0.2 mmol/L高氯酸沉淀蛋白，12 000 r/min離心5 min后取上清液，飽和K2CO3調(diào)pH后上機分析。色譜柱：IntersilODS-3C18柱（5 μm, 150 mm×4.6 mm）。流動相：檸檬酸鈉緩沖鹽（pH4.5）-乙腈（87:13, v/v）。流速：0.8 ml/min。

1.3.8 TBA法檢測丙二醛（MDA）的含量 根據(jù)MDA檢測試劑盒說明書操作。取凍存的眶額葉20 mg按照1 mg/10 μl加入0.9%氯化鈉溶液進行勻漿，5 000 r/min離心15 min后取上清液進行測定。

1.3.9 可見光法檢測過氧化氫酶（CAT）活性 取20 μl預(yù)處理的眶額葉勻漿上清液，加入100 μl底物（65 mmol/L過氧化氫的磷酸緩沖鹽溶液，pH7.4）37℃反應(yīng)1 min后立即加入鉬酸銨終止反應(yīng)，405 nm處測定吸光度值。CAT活性以U/mg protein表示。

1.3.10 Western blot檢測Bcl-2和Caspase-3在各組中的表達變化 取-80℃凍存的各處理組大鼠眶額葉標本50 mg，加入組織裂解液后在冰上使用電動勻漿器勻漿。離心獲得組織蛋白提取液后以BCA法定量。SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)，封閉，加入特異性抗Bcl-2（1:1 500）、Caspase-3（1:500）、GAPDH一抗（1:2 000），4℃孵育過夜后加入HRP標記的二抗（1:5 000）孵育1 h，用PBST洗滌3次后加入ELC試劑，在多色熒光凝膠成像系統(tǒng)下顯色成像。結(jié)果用Quantity One圖像分析系統(tǒng)進行條帶光密度分析，目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度的比值作為蛋白表達的相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。多組之間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），所有樣本采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑郁行為學(xué)實驗結(jié)果比較

在曠場實驗中，模型組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠的活動里程低于空白組（P=0.000、0.000、0.000、0.001）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠的活動里程高于模型組（均P=0.000）。在懸尾實驗中，模型組、電針組、疼痛貼組大鼠的不動時間多于空白組（P=0.000、0.000、0.003）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠的不動時間少于模型組（P=0.008、0.000、0.000）。在強迫游泳試驗中，模型組、電針組、疼痛貼組大鼠的不動時間高于空白組（P=0.000、0.000、0.005）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠的不動時間低于模型組（P=0.005、0.000、0.000），見表1。

表1 抑郁行為學(xué)實驗結(jié)果比較Table1 Comparison of depression behavioral testresults

2.2 單胺遞質(zhì)測定結(jié)果比較

模型組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的NE含量低于空白組（均P=0.000）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的NE含量高于模型組（P=0.023、0.000、0.000）。模型組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的DA含量低于空白組（P=0.000、0.000、0.000、0.025）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的DA含量高于模型組（均P=0.000）。模型組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的5-HT含量低于空白組（均P=0.000）；疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的5-HT含量高于模型組（均P=0.000），見圖1。

圖1 單胺遞質(zhì)測定結(jié)果比較Figure1 Comparison of monoamine transmitter test results

2.3 氧化應(yīng)激測定結(jié)果

模型組、電針組、疼痛貼組大鼠眶額葉腦組織的MDA含量高于空白組（均P=0.000）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的MDA含量低于模型組（均P=0.000）。模型組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的CAT活性低于空白組（P=0.000、0.000、0.000、0.001）；疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的CAT活性高于模型組（均P=0.000），見圖2。

圖2 氧化應(yīng)激測定結(jié)果比較Figure2 Comparison of oxidative stress test results

2.4 Bcl-2、Caspase-3蛋白表達變化

模型組、電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的Bcl-2蛋白表達低于空白組（P=0.000、0.000、0.000、0.004）；疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的Bcl-2蛋白表達高于模型組（均P=0.000）。模型組、電針組、疼痛貼組大鼠眶額葉腦組織的Caspase-3蛋白表達高于空白組（均P=0.000）；電針組、疼痛貼組、聯(lián)合治療組大鼠眶額葉腦組織的Caspase-3蛋白表達低于模型組（均P=0.000），見圖3。

3 討論

單胺遞質(zhì)缺乏假說是當前公認程度較高的抑郁癥發(fā)病假說。抑郁癥患者特別是自殺患者腦脊液中5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）濃度均低于正常值，5-HT轉(zhuǎn)運體的結(jié)合位點顯著減少，血小板和腦組織中5-HT的再攝取存在障礙。尸檢發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者腦組織β-腎上腺素受體密度和親和力增加，研究者推測這是腎上腺素能神經(jīng)元突觸減少后的繼發(fā)表現(xiàn)[9]。有研究報道抑郁癥患者的中腦-邊緣多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)中的多巴胺（DA）降低，而多巴胺對于調(diào)節(jié)動機和獎賞效應(yīng)有重要作用，多巴胺的減少可能是興趣和愉快感散失等抑郁癥表現(xiàn)的機制之一。

圖3 大鼠眶額葉腦組織中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達變化結(jié)果比較Figure3 Comparison of change of Bcl-2 and Caspase-3 protein expression in orbital frontal lobe brain tissue of rats

在慢性痛和抑郁的發(fā)病過程中有氧化應(yīng)激的參與，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡且傾向于氧化作用，體內(nèi)因此產(chǎn)生了大量氧化中間產(chǎn)物進而引發(fā)組織損害。在氧化應(yīng)激發(fā)生后，機體內(nèi)的免疫系統(tǒng)被激活，并產(chǎn)生大量的炎性因子，致使中性粒細胞炎性浸潤；下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）被激活，造成人體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂。有研究證實氧化應(yīng)激與抑郁癥發(fā)生有關(guān)聯(lián)性：氧化應(yīng)激指數(shù)增高則漢密爾頓抑郁評定量表得分也會相應(yīng)地增高，反之則降低[10]。氧化應(yīng)激的中間代謝產(chǎn)物如MDA的含量與疼痛的強度呈正相關(guān)。

曠場實驗中模型組大鼠的活動里程低于空白組，而懸尾實驗、強迫游泳實驗中模型組大鼠的不動時間均高于空白組，提示與空白組相比，脛骨癌痛模型大鼠存在抑郁樣行為學(xué)改變。模型組大鼠眶額葉腦組織的5-HT、NE、DA含量均明顯低于空白組，提示疼痛導(dǎo)致腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)平衡失調(diào)。過氧化氫酶（CAT）屬于酶抗氧化系統(tǒng)，模型組大鼠眶額葉腦組織的MDA含量高于空白組、CAT活性低于空白組，提示模型組氧化應(yīng)激反應(yīng)加重。氧化應(yīng)激可以破壞細胞膜和蛋白質(zhì)分子、降解細胞骨架、激活NF-κB和caspase-3通路，導(dǎo)致細胞的凋亡[11]。模型組Bcl-2表達減少，而Caspase-3蛋白增多，提示氧化應(yīng)激引發(fā)抗凋亡因子減少和caspase-3通路激活，進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡，加重神經(jīng)退行性改變，這可能也是脛骨癌痛模型大鼠抑郁樣行為學(xué)改變的重要原因。

電針是現(xiàn)代科學(xué)與祖國醫(yī)學(xué)的結(jié)合產(chǎn)物，用于抑郁癥的治療已經(jīng)被證實療效明確[12-13]。百會穴是百脈聚會于巔頂所在，是調(diào)節(jié)大腦功能的重要穴位，而印堂穴具有寧心安神的作用。針刺百會、印堂穴可以調(diào)補氣血、健腦寧神、安神定志，對抑郁癥的緩解有良好作用。

從中醫(yī)理論來說，疼痛有虛實之不同，因?qū)嵳咧^“不通則痛”，因虛者謂“不榮則痛”。實性疼痛主要是由六淫外邪或者痰濕淤血等內(nèi)邪阻滯經(jīng)絡(luò)，使經(jīng)絡(luò)不暢通，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中有“經(jīng)脈流行不止，環(huán)周不休，泣而不行，脈中則氣不通，故卒然而痛”闡述，認為氣血不通是疼痛產(chǎn)生的重要原因，此外，尚有由“風(fēng)、寒、濕三氣雜至合而為痹”而致的“不通則痛”。再者，虛性疼痛的另一主要病理機制為“不榮則痛”，多為氣血消耗所致。但癌性疼痛現(xiàn)在臨床上以“不通則痛”的病理性疼痛為主，故治療的關(guān)鍵在于行氣活血、散積止痛。

疼痛貼由蟾酥、生川烏、蚤休、莪術(shù)、細辛、乳香、沒藥等配制而成，由武漢市第一醫(yī)院制劑室將中藥碾粉末，以一定的比例加入基質(zhì)混合，制成藥膏，用時根據(jù)需要劑量的大小涂在醫(yī)用布膠膏上，然后敷貼在相應(yīng)的部位。中藥外敷是臨床治療癌性疼痛常用劑型，依據(jù)“內(nèi)病外治”理論配制而成。方中莪術(shù)、細辛、蟾酥、蚤休行氣破血，配以乳香、沒藥活血散結(jié)止痛，并加用生川烏等藥以止痛制痛。全方組方配伍得當，共奏行氣活血、散積止痛之功。配以外敷貼劑，具有療效確切、操作簡便、價廉質(zhì)優(yōu)的特點。本研究進一步將電針與疼痛貼結(jié)合起來，可以發(fā)揮兩種治療方式的各自優(yōu)勢，而研究結(jié)果也證實了這一點。

曠場實驗中三組治療組大鼠的活動里程均高于模型組，而懸尾實驗、強迫游泳實驗中模型組大鼠的不動時間均低于模型組，提示電針治療、疼痛貼治療以及聯(lián)合治療均可以改善脛骨癌痛模型大鼠的抑郁樣行為學(xué)改變。三組治療組大鼠眶額葉腦組織的5-HT、NE、DA含量均明顯高于模型組，提示電針治療、疼痛貼治療以及聯(lián)合治療可以糾正疼痛導(dǎo)致的腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)平衡失調(diào)。三組治療組大鼠眶額葉腦組織的MDA含量低于模型組、CAT活性高于模型組，提示治療后模型大鼠的抗氧化能力增強，氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕，同時治療組Bcl-2表達增多，而Caspase-3蛋白降低，提示電針治療、疼痛貼治療以及聯(lián)合治療可以減輕神經(jīng)細胞凋亡，改善神經(jīng)退行性改變，從而改善脛骨癌痛模型大鼠的抑郁樣行為學(xué)改變。

綜上，本研究結(jié)果肯定了電針治療、疼痛貼治療以及聯(lián)合治療的抗抑郁作用，并從單胺類神經(jīng)遞質(zhì)平衡、抗氧化應(yīng)激和減輕神經(jīng)細胞凋亡的角度初步揭示了其機制，且多項指標反應(yīng)出電針聯(lián)合疼痛貼治療較單純的電針治療和疼痛貼治療更加有效，為擴大臨床應(yīng)用提供了思路和借鑒。未來應(yīng)進一步深化研究并優(yōu)化取穴，擴大治療效果和應(yīng)用范圍。