郅程，賴妙玲，廖德貴，郝卓芳，王業(yè)忠，吳力強，劉鍶鍶，曾淑蓮，黃紫燕，陳丹敏，袁忠民

0 引言

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤，在所有顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤中占70%左右，其中成年人中最常見、惡性程度最高、預后最差的腫瘤是膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma, GBM, WHOⅣ）[1]。該腫瘤具有惡性增殖和高侵襲性的特點，手術(shù)及放化療后腫瘤復發(fā)率高。

JNK/c-Jun信號通路在調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡和存活等基本生物學效應中扮演重要角色。JNK磷酸化下游底物c-Jun并使其激活后，可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力[2-4]。MKK4和MKK7作為絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogenactivated protein kinase kinase, MAPKK）家族的兩個成員，均可以磷酸化并激活JNK[5-7]。有報道稱MKK7通過調(diào)控JNK活性調(diào)控細胞凋亡[8-10]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251中，小分子干擾沉默MKK7表達后，可以抑制JNK/c-Jun激活[11]。為進一步了解JNK信號通路的調(diào)控機制，本研究通過采用免疫組織化學法、小分子干擾、轉(zhuǎn)染及Western blot等技術(shù)檢測不同組織學類型膠質(zhì)瘤樣本及U87細胞株中MKK7、c-Jun及其磷酸化的表達情況，分析并驗證MKK7是否為直接調(diào)控JNK/c-Jun活性的關(guān)鍵分子。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2015年11月—2017年11月廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科存檔的膠質(zhì)瘤石蠟包埋標本117例，其中92例膠質(zhì)瘤和25例膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織。按2016年版“WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的病理分類”，92例膠質(zhì)瘤中：WHOⅡ：彌漫型星形細胞瘤15例，少突膠質(zhì)細胞瘤5例；WHOⅢ：間變性星形細胞瘤11例，間變性少突膠質(zhì)細胞瘤8例；WHOⅣ：膠質(zhì)母細胞瘤53例（僅25例有相應的正常對照），患者臨床病理特征見表1。所有患者術(shù)前均未行放化療，均知情同意。本研究得到醫(yī)院醫(yī)學倫理會審核批準。

人腦膠質(zhì)瘤U87細胞株購自上海細胞生物學研究所中國科學院細胞庫。胎牛血清、0.25%胰酶購于美國Gibco公司。培養(yǎng)基高糖DMEM、轉(zhuǎn)染試劑RNAi MAX、opti-MEM reduced serum medium均購于美國Invitrogen公司。MKK7-1 siRNA、MKK7-2 siRNA、MKK4 siRNA、空白對照siRNA購自上海Gene Pharma公司。anti-MKK7(#4172)、anti-MKK4(#9152)、anti-p-c-Jun(#3270)、anti-GAPDH（#2118s）均購于美國Cell Signaling Technology公司。anti-c-Jun(sc-74543)購美國Santa Cruz Biotechnology公司。

MKK4-siRNA小分子片段序列正義鏈：5'-GCCUUACGAAGGAUGAAUCCATT-3'，反義鏈：5'-UGGAUUCAUCCUUCGUAAGGCTT-3'；M K K 7-s i R N A 1小分子片段序列正義鏈：5'-CCAACACGGACGUCUUCAU-3'，反義鏈：5'-AUGAAGACGUCCGUGUUGG-3'；MKK7-siRNA2小分子片段序列正義鏈：5'-GCUGGCAACAGGACAGUUU-3'，反義鏈：5'-AAACUGUCCUGUUGCCAGG-3'。

表1 92例膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征Table1 Clinicopathological features of 92 gliomas patients

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色及評判標準 所有石蠟包埋病理標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)HE染色組織學觀察。采用Envision二步法進行免疫組織化學染色。檢測標志物：MKK7、c-Jun和p-c-Jun。4 μm厚度切片經(jīng)脫蠟水化和抗原修復后，滴加一抗，放入37℃水浴箱孵育60 min，PBS沖洗后按照采用Envision檢測試劑盒（DAKO公司）說明書進行，室溫孵育30 min，再次PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精對比染色，然后脫水、透明、封片，每例均設(shè)陽性和陰性對照。按照抗體說明書分別用膀胱組織及肺癌組織作為陽性對照，另外用PBS代替一抗作為陰性對照。

免疫組織化學結(jié)果半定量判定：染色程度：基本不著色為0分；著色呈淡黃色為1分；著色呈黃色為2分；著色呈棕褐色為3分。染色陽性細胞百分比計數(shù)，計算陽性腫瘤細胞占總腫瘤細胞的比例，將其分為5個等級：著色陽性細胞占計數(shù)細胞≤5%為0分（-），5%～25%為1分（+），＞25%～50%為2分（++），＞50%～75%為3分（+++），＞75%為4分（++++）。將染色程度分級與染色細胞百分比相乘，乘積≥4分為高表達，＜4分為低表達[12-13]。

1.2.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和Western blot檢測 將U87細胞株置于10%胎牛血清、高糖DMEM液體培養(yǎng)液， 37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3～5天用胰酶消化傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

于6孔板內(nèi)接種對數(shù)生長期U87細胞，細胞密度為2×105個每孔，培養(yǎng)液為不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液。待細胞生長至60%～80%融合度時，更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)液，12 h后按轉(zhuǎn)染試劑RNAi MAX轉(zhuǎn)染方法將MKK4-siRNA、MKK7-siRNA1、MKK7-siRNA2和空白對照siRNA分別轉(zhuǎn)染入U87細胞。

U87轉(zhuǎn)染細胞于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，每孔2 ml PBS漂洗2遍，每孔加入150 μl IP細胞裂解液（50 mmol/L Tris, HCl pH8.0, 150 mmol/L NaCl,1%Triton×100, 100 μg/ml PMSF），10 min后收集各組細胞。按照IP裂解液法提取細胞總蛋白，并進行BCA法測定蛋白濃度。灌制4%集成膠和10%分離膠。200 V電壓電泳45 min。100 V電壓轉(zhuǎn)膜60 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗（anti-MKK4 1:1 000，anti-MKK7 1:1 000，anti-c-Jun 1:1 000，anti-p-c-Jun 1:1 000，anti-GAPDH 1:5 000）4℃孵育過夜，HRP標記抗兔或抗鼠室溫孵育1 h。ECL化學發(fā)光后曝光。

1.3 統(tǒng)計學方法

用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)處理。多組間MKK7及p-c-Jun表達率的比較用多個樣本率的χ2檢驗。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（x±s）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析One-way ANOVA，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 c-Jun和p-c-Jun在膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織中的表達

圖1 不同WHO分級膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織中c-Jun、p-c-Jun、MKK7的表達Figure1 Expression of c-Jun, p-c-Jun and MKK7 in gliomas with different WHO classif i cation and normal brain tissues adjacent to glioblastoma

c-Jun和p-c-Jun陽性表達表現(xiàn)為細胞核內(nèi)見棕黃色顆粒，見圖1。25例膠質(zhì)母細胞瘤中3例（12%）c-Jun高表達，其瘤旁正常腦組織中均低表達，兩者間差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.128,P=0.077），而膠質(zhì)母細胞瘤中p-c-Jun高表達19例（76%），明顯高于瘤旁正常腦組織6例（4%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=27.000, P=0.000）。膠質(zhì)母細胞瘤中c-Jun的表達與其他類型膠質(zhì)瘤無明顯差異（P=0.086），但p-c-Jun表達明顯升高（P=0.000），見表2。根據(jù)WHO分級，WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤p-c-Jun高表達率明顯高于WHO Ⅱ級及WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤（P=0.000），見圖2A，且p-c-Jun表達強度與膠質(zhì)瘤WHO分級呈明顯正相關(guān)（r=0.494, P=0.000）。

圖2 MKK7及p-c-Jun在膠質(zhì)瘤中的表達相關(guān)性分析Figure2 Correlation of MKK7 and p-c-Jun expression in gliomas

表2 不同組織學類型膠質(zhì)瘤組織中c-Jun及p-c-Jun表達情況Table2 c-Jun and p-c-Jun expression in different histological types of gliomas

2.2 MKK7在膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織中的表達

MKK7陽性表達表現(xiàn)為細胞核或質(zhì)內(nèi)見棕黃色顆粒，見圖1。膠質(zhì)母細胞瘤中MKK7的表達高于其他類型膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織（P=0.000），見表3。且MKK7高表達率隨著WHO分級的升高而增加（P=0.000），見圖2A。MKK7表達強度與膠質(zhì)瘤WHO分級呈明顯正相關(guān)（r=0.606, P=0.000）。

表3 不同組織學類型膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織組織中MKK7表達情況Table3 MKK7 expression in gliomas with different histological types and normal brain tissues adjacent to glioblastoma

2.3 c-Jun磷酸化與MKK7在不同WHO級別膠質(zhì)瘤組織中的表達及其相關(guān)性

92例膠質(zhì)瘤及25例膠質(zhì)瘤母細胞瘤瘤旁正常腦組織中，48例MKK7和p-c-Jun均高表達，31例均低表達，30例MKK7高表達和p-c-Jun低表達，8例MKK7低表達和p-c-Jun高表達。根據(jù)Spearman相關(guān)分析檢驗，MKK7表達與c-Jun磷酸化水平正相關(guān)（r=0.387, P=0.000），見圖2B。

2.4 轉(zhuǎn)染siRNA對MKK4、MKK7表達及c-Jun活性的影響

與空白對照組siRNA相比，U87細胞轉(zhuǎn)染MKK4-siRNA、MKK7-siRNA1和MKK7-siRNA2可分別顯著抑制MKK4（P=0.003）和M K K 7（P=0.0 0 9）表達，但只有轉(zhuǎn)染MKK7-siRNA可同時下調(diào)c-Jun磷酸化水平（P=0.004），見圖3。

圖3 U87細胞株小分子干擾對MKK4、MKK7的表達及對c-Jun活性的影響Figure3 Effects of siRNAs on MKK4, MKK7 expression and c-Jun activities in glioma U87 cell line analyzed by Western blot

3 討論

c-Jun N-末端激酶（C-Jun N-terminal kinase,JNK）屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，其家族包括JNK1、JNK2和JNK3[14]，其中JNK1和JNK2廣泛表達于各種組織中，而JNK3主要表達于腦、心臟及睪丸等組織中[15]。JNKs參與許多生理過程，如炎性反應、細胞增殖、分化及死亡，Nacken等[16]研究表明JNK活化可促進流感病毒A（IAV）的非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）的表達，從而誘導細胞的凋亡。而且腫瘤的發(fā)生和進展也存在JNKs的持續(xù)激活，有研究通過體內(nèi)或體外實驗證明多種惡性腫瘤與JNK/c-Jun的激活密切相關(guān)，如胃癌、肝癌、胰腺癌、骨肉瘤、腦腫瘤及結(jié)直腸癌等中均存在不同JNK蛋白的高表達或突變[17-20]。本研究基于免疫組織化學方法，探討膠質(zhì)瘤中c-Jun的磷酸化水平的表達情況。與正常腦組織及非膠質(zhì)母細胞瘤相比，膠質(zhì)母細胞瘤中磷酸化c-Jun的表達明顯升高，膠質(zhì)母細胞瘤的高表達率為81.1%，表明磷酸化c-Jun過表達參與了膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生與發(fā)展。

替莫唑胺（TMZ）是目前公認的治療腦膠質(zhì)瘤效果較好的化療藥物，然而腦膠質(zhì)瘤對TMZ產(chǎn)生耐藥性是導致化療失敗的重要原因。因此，為膠質(zhì)母細胞瘤的化療尋找新的靶點及新的化療藥物成為了膠質(zhì)瘤的研究熱點。有研究證明在JNK/c-Jun激活后，可以增強替莫唑胺和尼莫司汀等烷化劑等藥物對膠質(zhì)母細胞瘤的促凋亡作用。Tomicic等[21]發(fā)現(xiàn)烷基化抗癌藥物作用于膠質(zhì)瘤細胞LN-229后，JNK/c-Jun激活參與了晚期促凋亡反應。Ueno等[22]通過建立耐TMZ細胞模型，與對照組相比，試驗組c-Jun終末激酶（JNK）的磷酸化水平增加，其下游信號通路的活性增加。上調(diào)JNK表達或siRNA特異性干擾及JNK抑制劑抑制JNK表達可以促進或抑制試驗組細胞遷移及侵襲。因此，表明JNK信號通路可能成為新型治療TMZ耐藥膠質(zhì)瘤的靶點。本研究也進一步證明不同級別膠質(zhì)瘤c-Jun的表達水平不同，為膠質(zhì)瘤的化療，特別是TMZ耐藥的處理提供了證據(jù)。

JNK/c-Jun通路的激活在膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，但其上游調(diào)控機制并不完全清楚。JNK上游有兩個MAPKK，即 MKK4和MKK7。我們通過小分子干擾的方法沉默膠質(zhì)瘤U87細胞株中MKK4及MKK7，發(fā)現(xiàn)沉默MKK7后c-Jun磷酸化水平明顯下調(diào)，而沉默MKK4后c-Jun磷酸化水平無明顯變化，在細胞學水平證明了MKK7是調(diào)控JNK/c-Jun活性及膠質(zhì)瘤細胞增殖的關(guān)鍵分子。為了進一步探討MKK7和磷酸化c-Jun的表達在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)系。本研究檢測了膠質(zhì)母細胞瘤瘤旁正常腦組織與不同組織學類型及WHO分級的膠質(zhì)瘤中MKK7和磷酸化c-Jun的表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著膠質(zhì)瘤WHO分級的增加，MKK7及磷酸化c-Jun的高表達率明顯升高；且MKK7及磷酸化c-Jun的表達正相關(guān)，進一步驗證了MKK7及JNK/c-Jun通路的信號在膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的中的重要作用，為尋找膠質(zhì)瘤化療的新靶點、新化療藥物提供重要的理論依據(jù)。