鄔旭龍，肖 璐，林 華，楊澤曉，姚學(xué)萍，王 印*，張鵬飛，姜睿姣

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都611134；3.四川省畜牧科學(xué)研究院四川成都610066；4.成都海關(guān)，四川成都6l004l)

豬偽狂犬病毒(PRV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬瘟病毒(CFSV)、非洲豬瘟病毒(ASFV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)及豬細(xì)小病毒(PPV)是豬呼吸與繁殖系統(tǒng)常見(jiàn)病原，且CSFV、PCV-2、PRRSV、PRV、PPV 能夠引起免疫抑制，引起繼發(fā)感染，加重病情、造成死亡，給豬場(chǎng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。其中ASFV 于2018 年8月首次被報(bào)道傳入我國(guó)，已蔓延超過(guò)20 省，其傳染性強(qiáng)、致死率高，威脅巨大[4-5]。

QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳(QIAxcel CGE Capillary gel electrophoresis，QIAxcel CGE)分析系統(tǒng)，是新一代的核酸片段分析系統(tǒng)[6]。在高壓電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下，各組分的分子大小、帶電荷數(shù)、等電點(diǎn)等性質(zhì)不同，從而形成不同遷移速率，各組分依次移動(dòng)至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測(cè)器[7]，檢測(cè)和記錄其吸光度，并將各組分以吸收峰的形式動(dòng)態(tài)直觀(guān)地記錄下來(lái)，自動(dòng)分析出各目的片段的堿基數(shù)，該技術(shù)的出現(xiàn)極大地簡(jiǎn)化了PCR 產(chǎn)物的分析步驟[8]、提高了檢測(cè)效率，且分辨率可達(dá)3 bp～5 bp，優(yōu)勢(shì)突出。

本研究以多重PCR 為基礎(chǔ)，并結(jié)合毛細(xì)管電泳建立了上述7 種病毒的新型檢測(cè)平臺(tái)，有效降低檢測(cè)成本，提高檢測(cè)效率，對(duì)毛細(xì)管凝膠技術(shù)在國(guó)內(nèi)的發(fā)展，尤其是在動(dòng)物疾病診斷中的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 PRV (Bartha-K61 株、HB-98株活疫苗)、JEV(SA14-14-2 株活疫苗、HW1 株滅活疫苗)、CSFV(細(xì)胞源活疫苗)、PCV-2 (CP08 株、WH 株、ZJ/C 株滅活疫苗)、PRRSV (R98 株、JXA1-R 株滅活苗)、PPV (CP-99 株、WH-1 滅活苗)、豬O 型口蹄疫病毒(FMDV-O，O/GX/09-7 株+O/XJ/10-11 株)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV，華毒株）、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV，CV777 株)的核酸由本研究室提取自各疫苗。ASFV p72 質(zhì)粒由InvitrogenTM合成。副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)、豬傳染性胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)菌株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室分離保存。65 份經(jīng)國(guó)標(biāo)或行標(biāo)檢測(cè)為PRV、CSFV、JEV、PCV、PRRSV 或PPV 一種或多種病毒核酸陽(yáng)性的臨床樣本均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存、提供，樣本包括脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟、肝臟、流產(chǎn)胎等。

1.3 引物設(shè)計(jì) 從NCBI GenBank 中下載數(shù)株各病毒全基因序列，經(jīng)DNAMAN、DNAStar 等軟件分析，選取各病毒保守基因利用Oligo 7、Primer 5 等軟件設(shè)計(jì)7 對(duì)特異性引物。選取非同源性序列，設(shè)計(jì)1 對(duì)通用引物并在各特異性引物的5' 端添加通用引物序列(表1)。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.4 各病原重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 參考TIAN amp Virus DNA/RNA Kit 說(shuō)明書(shū)，分別提取PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 基因組核酸，并將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以DNA 或cDNA 為模板，分別進(jìn)行單一PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃3 min；94 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃45 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃3 min。將各PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收純化后分別克隆于pMD19-T 載體中，各陽(yáng)性重組質(zhì)粒由InvitrogenTM公司測(cè)序。

1.5 多重PCR 體系的建立和優(yōu)化

1.5.1 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 多重PCR 采用25 μL反應(yīng)體系，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，混合特異性引物3.5 μL，上下游通用引物各1 μL，模板3 μL，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)程序：第一階段：94 ℃3 min；第二階段：富集和加標(biāo)簽階段，94 ℃30 s，退火30 s，72 ℃1 min，10 個(gè)循環(huán)；第三階段：指數(shù)擴(kuò)增，94 ℃30 s，退火45 s，72 ℃1 min，34 個(gè)循環(huán)；第四階段：72 ℃總延伸3 min。

1.5.2 退火溫度及引物濃度的優(yōu)化 在25 μL 反應(yīng)體系優(yōu)化中，控制變量單一，首先對(duì)靶序列富集階段退火溫度進(jìn)行優(yōu)化(50 ℃～60 ℃)，再保持其它條件一致，利用最優(yōu)的靶序列富集階段退火溫度，對(duì)指數(shù)擴(kuò)增階段的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化(50 ℃～60 ℃)，每個(gè)退火溫度梯度均設(shè)2 平行孔。采用最優(yōu)的退火溫度，預(yù)混14 條特異性引物使其體系濃度分別為：0.028 μmol/L、0.056 μmol/L、0.084 μmol/L、0.112 μmol/L、0.140 μmol/L、0.168 μmol/L、0.196 μmol/L、0.224 μmol/L、0.252 μmol/L、0.280 μmol/L，對(duì)特異性引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，采用已確定最優(yōu)的退火溫度及特異性引物濃度，對(duì)通用引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，使其體系終濃度分別為0.16 μmol/L、0.32 μmol/L、0.48 μmol/L、0.64 μmol/L、0.8 μmol/L、0.96 μmol/L、1.12 μmol/L、1.28 μmol/L、1.44 μmol/L、1.6 μmol/L，每孔均設(shè)2個(gè)復(fù)孔。根據(jù)不同條件下獲得的平行孔中各靶序列熒光信號(hào)取平均值(四舍五入后)進(jìn)行最優(yōu)條件篩選，建立能夠同時(shí)檢測(cè)PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 及ASFV 7 種豬病毒的多重PCR QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè)平臺(tái)(PCR-QIAxcel)。

1.6 特異性試驗(yàn) 采用TIAN amp Virus DNA/RNA Kit 提取FMDV-O、PEDV、TGEV 各商品疫苗核酸，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；采用TIAN amp Bacteria DNA Kit，提取HPS、APP、S.suis細(xì)菌基因組核酸，將7種特異性病原與FMDV-O、PEDV、TGEV、HPS、APP、S.suis菌毒株的基因組混合，采用優(yōu)化后的PCR-QIAxcel 進(jìn)行特異性驗(yàn)證。判讀標(biāo)準(zhǔn)為157 bp～162 bp 可判斷為PRV，174 bp ～179 bp 可判斷為CSFV，208 bp～213 bp 可判斷為JEV，253 bp～258 bp可判斷為PCV-2，301 bp～306 bp 可判斷為PRRSV，351 bp～356 bp 可判斷為PPV，336 bp～341 bp 可判斷為ASFV。

1.7 靈敏度試驗(yàn) 利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定7 種病毒重組質(zhì)粒的濃度，并換算成拷貝數(shù)，對(duì)該7 種病毒的混合質(zhì)粒10 倍倍比稀釋?zhuān)捎盟CR-QIAxcel 方法測(cè)定其最低檢測(cè)限。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 采用本實(shí)驗(yàn)建立的PCR-QIAxcel方法，以濃度均為105拷貝/μL 經(jīng)混合的上述7 種重組質(zhì)粒模板作為模板，設(shè)置3 個(gè)平行組，收集每組中所有目的條帶對(duì)應(yīng)堿基數(shù)的數(shù)值，分析其變異系數(shù)(CV)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床應(yīng)用 采用所建立的方法，對(duì)臨床采集保存的65 份臨床樣本進(jìn)行PRV、 JEV、 CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV 及ASFV 7 種病毒的檢測(cè)。同時(shí)參考國(guó)家推薦標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)方法(PRV：GB/T 18641-2002；JEV：GB/T 22333-2008；CSFV： GB/T 16551-2008； PCV-2： GB/T 21674-2008； PRRSV： GB/T 27517-2011； PPV： SN/T 1874-2007；ASFV：SN/T 1559-2010)，對(duì)65 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與PCR-QIAxcel 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 各病原重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 對(duì)不同病原的核酸經(jīng)單一PCR 擴(kuò)增顯示PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV 擴(kuò)增的目的條帶分別為159 bp、177 bp、211 bp、254 bp、304 bp、353 bp，人工合成ASFV p72 質(zhì)粒PCR 擴(kuò)增可見(jiàn)340 bp 的目的條帶(圖1)。將各PCR 膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接，經(jīng)克隆、轉(zhuǎn)化篩選出的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將結(jié)果與NCBI GenBank 中BLAST 比對(duì)顯示，重組質(zhì)粒中插入片段與各病原參考株的同源性均大于99%。表明PCR 擴(kuò)增的基因片段均分別為各病毒的特異性片段，且各重組質(zhì)粒均正確構(gòu)建。

2.2 多重PCR 體系的建立和優(yōu)化結(jié)果 經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化，該P(yáng)CR-QIAxcel 方法的最佳反應(yīng)條件為：94 ℃3 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃60 s，10 個(gè)循環(huán)；94 ℃30 s，51 ℃45 s，72 ℃60 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸3 min。最佳反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，混合特異性引物3.5 μL (終濃度為0.056 μmol/L)，混合通用引物2 μL (終濃度為0.64 μmol/L)，模板3 μL，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids by PCR

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 采用建立的PCR-QIAxcel 進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果顯示僅有7 種特異性病原出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)峰值，且條帶大小與預(yù)期相同，對(duì)照菌毒株均未見(jiàn)熒光信號(hào)峰(圖2)，表明該方法能很好的擴(kuò)增并區(qū)分不同的目標(biāo)片段，具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 PCR-QIAxcel 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Cross-reactivity results of PCR-QIAxcel

2.4 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 采用7 對(duì)特異性引物和一對(duì)通用引物，對(duì)PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 多重PCR 毛細(xì)管電泳檢測(cè)的靈敏度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限分別為：4.56×103拷貝/μL、6.35×103拷貝/μL、1.98×103拷貝/μL、1.32×104拷貝/μL、3.21×103拷貝/μL、4.51×103拷貝/μL、3.37×103拷貝/μL。表明該多重檢測(cè)方法靈敏度較高，最低檢測(cè)限可達(dá)103拷貝/μL～104拷貝/μL，但比國(guó)標(biāo)或行標(biāo)里對(duì)應(yīng)病毒單一PCR 檢測(cè)方法的靈敏度略低。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 采用本研究建立的PCR-QIAxcel進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在3 次重復(fù)試驗(yàn)中，QIAxcel 系統(tǒng)對(duì)7 種PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小判讀穩(wěn)定，各產(chǎn)物堿基數(shù)值的變異系數(shù)均小于1.0 %，表明該方法重復(fù)性較好。

圖3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Result of sensitivity test

表2 PCR 產(chǎn)物堿基數(shù)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability results of base pair size of PCR products

2.6 臨床應(yīng)用 利用本研究建立的PCR-QIAxcel 對(duì)65 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，以國(guó)標(biāo)或行標(biāo)單一PCR 檢測(cè)方法為基準(zhǔn)，65 份臨床樣本中有53份檢出PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV中的一種或兩種病毒核酸陽(yáng)性，ASFV 未檢出，該53 份陽(yáng)性樣本中，僅檢出PRV、JEV、CSFV、PCV-2、PRRSV、PPV、ASFV 中1 種病毒的樣本數(shù)量為35 份，檢出兩種病毒的樣本數(shù)量為16 份，檢出3 種病毒的樣本數(shù)量為2 份，兩種或兩種以上混合感染的樣本檢出率為34.0 % (18/53)。總體上看，PCR-QIAxcel 共檢出47 份陽(yáng)性樣本，陽(yáng)性樣本的檢出率為72.31 % (47/65)。在單一病原的檢測(cè)中，PCR-QIAxcel 與國(guó)標(biāo)、行標(biāo)的單一PCR 檢測(cè)方法的一致性為94.3 % (33/35)，而混合病原檢測(cè)二者的一致性為77.7 % (14/18)。總體而言，兩種方法的檢測(cè)符合率為88.68 %。該臨床樣本檢測(cè)結(jié)果表明，在單一感染的檢測(cè)中，PCR-QIAxcel 與國(guó)標(biāo)或行標(biāo)中規(guī)定的單一PCR 檢測(cè)方法相比，其一致性較高，但在多重感染的檢測(cè)中，其檢出率均低于單一PCR檢測(cè)方法(表3)。表明PCR-QIAxcel 在臨床樣品檢測(cè)中，尤其是混合感染樣品的檢測(cè)中，其檢測(cè)靈敏度不及單一PCR。

表3 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection result of clinical samples

3 討 論

QIAxcel CGE 系統(tǒng)在核酸檢測(cè)中，尤其是對(duì)多重PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)中QIAxcel CGE 優(yōu)勢(shì)突出：第一，分辨率高、最低可對(duì)片段大小僅間隔3 bp～5 bp的產(chǎn)物進(jìn)行辨別，且能夠根據(jù)遷移時(shí)間和峰面積直接讀出目的片段大?。坏诙?，靈敏度高，核酸的最低檢測(cè)限可達(dá)0.1 ng/μL；其三，高效快捷、操作性強(qiáng)，成熟的配套商品化試劑極大地簡(jiǎn)化了即用型預(yù)制卡夾的使用，省去了常規(guī)凝膠電泳配膠、制膠、上樣、拍照等繁瑣過(guò)程，12 個(gè)樣本的電泳檢測(cè)及分析僅需要約12 min；第四，安全環(huán)保，避免接觸核酸染料、紫外光、電泳緩沖等有機(jī)廢液，降低有毒有害物質(zhì)對(duì)人及環(huán)境的危害。

多重PCR 的核心在于多對(duì)引物的設(shè)計(jì)，為保證其擴(kuò)增效率，各PCR 產(chǎn)物大小宜控制在100 bp～400 bp 之內(nèi)，這增加了引物設(shè)計(jì)的難度，導(dǎo)致PCR的“重?cái)?shù)”越多、各目的條帶的大小越接近，從而使得普通的凝膠電泳越難以對(duì)各目的片段進(jìn)行很好地區(qū)分[9]。而將多重PCR 與QIAxcel CGE 聯(lián)用，便能很好地解決因目的條帶大小過(guò)于接近所導(dǎo)致的普通凝膠電泳難以分開(kāi)的難題，且檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)也大大縮短，與常規(guī)凝膠電泳相比，電泳時(shí)間縮短三分之二，檢測(cè)效率大幅提高，QIAxcel CGE 在PCR 產(chǎn)物的快速篩查中發(fā)展?jié)摿薮?。本研究在靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[10-11]，針對(duì)每一個(gè)靶序列，僅采用一對(duì)帶標(biāo)簽序列的特異性引物進(jìn)行靶序列富集，結(jié)合QIAxcel CGE 系統(tǒng)，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)PRV、CSFV、JEV、PCV-2、PRRSV、ASFV、PPV 7 種豬病毒的多重檢測(cè)平臺(tái)。

多重PCR 體系中特異性引物濃度極低，在反應(yīng)的前10 個(gè)循環(huán)便被耗盡，使得第二擴(kuò)增階段體系中僅由通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，減少了引物之間的非特異性結(jié)合，提升了擴(kuò)增效率，提高靈敏度。本研究所建立的PCR-QIAxcel 對(duì)各病原質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限為103拷貝/μL～104拷貝/μL，與其它常見(jiàn)的豬病毒或細(xì)菌性病源均未出現(xiàn)交叉反應(yīng)，多重PCR 擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性高，QIAxcel CGE 系統(tǒng)對(duì)目的條帶大小判讀結(jié)果的變異系數(shù)均小于1 %。該方法特異、靈敏、高效、穩(wěn)定、安全且簡(jiǎn)潔，實(shí)現(xiàn)了多病毒在單管中同時(shí)檢測(cè)，在高通量檢測(cè)中意義深遠(yuǎn)，但在混合病原的檢測(cè)中，PCR-QIAxcel 檢出率低于單一PCR，究其原因主要在于多重檢測(cè)體系中引物多、擴(kuò)增片段多，在擴(kuò)增過(guò)程中，不同引物與引物之間、引物與其非靶片段之間、靶片段與靶片段之間難免會(huì)相互產(chǎn)生一定的干擾，而這些無(wú)法完全規(guī)避的干擾使得多重檢測(cè)的檢出率低于單一檢測(cè)。要提高多重檢測(cè)方法的靈敏度，可從以下幾方面進(jìn)行：第一，在采集組織樣品時(shí)，應(yīng)選取多種不同臟器并將其混合后提取核酸進(jìn)行檢測(cè)，以降低因不同病原在豬體內(nèi)各器官中分布和含量的差異而導(dǎo)致的靈敏度下降；第二，盡量采集新鮮的組織樣品并及時(shí)檢測(cè)，以求獲取更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果；第三，嚴(yán)格規(guī)范組織樣品核酸提取過(guò)程，以免不規(guī)范操作導(dǎo)致核酸降解而影響檢測(cè)結(jié)果。

本研究建立的多重檢測(cè)技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高，結(jié)果判讀直接、方便，無(wú)需以瓊脂糖作支持介質(zhì)，省去制膠、拍照等繁瑣過(guò)程，極大地簡(jiǎn)化了分析步驟、提高檢測(cè)效率，并且安全，快捷，在高通量檢測(cè)體系中應(yīng)用潛能巨大。但QIAxcel CGE 系統(tǒng)也存在一些不足，例如對(duì)PCR 產(chǎn)物判讀存在3 bp～5 bp 的誤差，尤其是濃度較高的目的片段誤差最大可達(dá)8 bp～10 bp，這會(huì)對(duì)結(jié)果判定有一些影響，尤其是對(duì)堿基數(shù)相差較小的目的片段的判定，同時(shí)，這給PCR 擴(kuò)增體系建立提出了新的挑戰(zhàn)，要求在保證檢測(cè)靈敏度的前提下，應(yīng)盡量調(diào)整各引物對(duì)濃度，使其擴(kuò)增效率差異最低，以呈現(xiàn)最準(zhǔn)確的結(jié)果。