陳元昊 周勐生 殷曉宇 賀怡 王偉 郝景茹 韓園 高燦

[摘要] 目的 探討急性束縛應激對小鼠AMPA受體跨膜轉運和恐懼記憶的影響及其機制。 方法 將64只雄性C57BL/6小鼠采用隨機數(shù)字表法分為對照組、普萘洛爾組、束縛應激組、聯(lián)合組（束縛應激+普萘洛爾），每組16只。普萘洛爾組和聯(lián)合組以10 mg/kg普萘洛爾溶液灌胃，同時對照組和束縛應激組以等容積的生理鹽水灌胃，給藥容積均為20 mL/kg。給藥30 min后，束縛應激組和聯(lián)合組小鼠用50 mL EP管束縛，束縛時間為30 min。采用條件性恐懼記憶實驗測定小鼠的恐懼記憶;采用免疫印記法測定小鼠海馬GluA1蛋白表達的變化、GluA1第831位（pS-831）和845位（pS-845）絲氨酸磷酸化水平變化、鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）表達及其磷酸化（p-CaMKⅡ）水平變化以及神經(jīng)元細胞膜上GluA1水平的變化。 結果 與對照組比較，束縛應激組的環(huán)境和聲音依賴的凍結時間均增加（P < 0.05），海馬pS-831和pS-845以及p-CaMKⅡ表達增加（P < 0.05），GluA1在細胞膜上表達增加（P < 0.05），而總蛋白中GluA1以及CaMKⅡ的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與束縛應激組比較，聯(lián)合組的環(huán)境和聲音依賴的凍結時間均降低（P < 0.05），海馬pS-831和pS-845以及p-CaMKⅡ表達減少（P < 0.05），GluA1在細胞膜上表達減少（P < 0.05），而總蛋白中GluA1、CaMKⅡ的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結論 急性束縛應激促進小鼠恐懼記憶的形成，其機制可能與調控GluA1亞基磷酸化，增加AMPA受體跨膜轉運有關。此外，β-腎上腺素受體（β-ARs）可能是束縛應激促進恐懼記憶的重要作用靶點之一。

[關鍵詞] 急性束縛應激;恐懼記憶;去甲腎上腺素;AMPA受體;跨膜轉運;普萘洛爾

[中圖分類號] R338? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（c）-0007-05

Effect of acute stress on AMPA receptors trafficking and fear memory in mice

CHEN Yuanhao1? ?ZHOU Mengsheng1? ?YIN Xiaoyu1? ?HE Yi1? ?WANG Wei2? ?HAO Jingru1? ?HAN Yuan1? ?GAO Can1

1.Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology & Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application， Xuzhou Medical University， Jiangsu Province， Xuzhou? ?221004， China; 2.Department of Neurology， the First People′s Hospital of Huainan， Anhui Province， Huainan? 232007， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of acute restraint stress on AMPA receptors trafficking and fear memory in mice and its mechanism. Methods Sixty-four male C57BL/6 mice were divided into control group， Propranolol group， restraint stress group， combined group （restraint stress + Propranolol）， according to random number table method， with 16 mice in each group. In the propranolol group and combined group， 10 mg/kg Propranolol solution was administered intragastrically， at the same time， the control group and the restraintstress group were intragastrically administered with an equal volume of normal saline， and the administration volume were 20 mL/kg. After 30 minutes of administration， the restraint stress group and combined group were restrained with 50 mL EP tube for 30 minutes. The fear memory of mice was evaluated by fear conditioning test. The expression of GluA1 in hippocampus， the level of serine phosphorylation at the 831th （pS-831） and the 845th （pS-845） of GluA1， the expression of calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ （CaMKⅡ） and its phosphorylation （p-CaMKⅡ） level， and the expression of GluA1 in the hippocampus cell membrane were measured by Western blot. Results Compared with the control group， the context-dependent and tone-dependent freezing time in the restraint stress group increased （P < 0.05）， the expression of pS-831， pS-845 and p-CaMKⅡ in hippocampus increasd （P < 0.05）， and the expression of GluA1 in cell membrane increased （P < 0.05）， while the expression of GluA1 and CaMKⅡ in total protein had no significant difference （P > 0.05）. Compared with the restraint stress group， the context-dependent and tone-dependent freezing time in the combined group decreased （P < 0.05）， the expression of pS831， pS845 and p-CaMKⅡ in hippocampus decreased （P < 0.05）， and the expression of GluA1 in cell membrane decreased （P < 0.05）， while the expression of GluA1 and CaMK Ⅱ in total protein had no significant difference （P > 0.05）.? Conclusion Acute restraint stress can promote the formation of fear memory in mice， which may be related to the regulation of GluA1 subunit phosphorylation and the increased trafficking of AMPA receptors. Moreover， β-adrenergic receptors （β-ARs） may be one of the important targets for restraint stress-induced fear memory.

[Key words] Acute restraint stress; Fear memory; Norepinephrine; AMPA receptor; Trafficking; Propranolol

學習記憶是大腦的基本功能，適度的應激可以促進學習記憶[1]。應激時藍斑核和側腦腦干釋放的去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）被認為是調控記憶形成的重要因素[2]，當NE與腦中β-腎上腺素受體（β-ARs）結合，能誘導長時程增強（long-term potentiation，LTP）的發(fā)生[3]。

現(xiàn)研究認為LTP主要是通過調控AMPA受體的跨膜轉運實現(xiàn)的[4]。AMPA受體是一種離子型谷氨酸受體，它是由GluA1～GluA4四個亞基組成的四聚體[5]。其中GluA1亞基在AMPA受體跨膜轉運方面發(fā)揮核心作用[6]。這種作用是通過GluA1亞基幾個重要位點的磷酸化實現(xiàn)的。其中被蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）催化的GluA1亞基第845位絲氨酸（Ser-845）以及被蛋白激酶C（proteinkinase C，PKC）和CaMKⅡ催化的GluA1亞基第831位絲氨酸（Ser-831）的磷酸化最為重要[7]。NE作用到β-ARs可以激活cAMP-PKA級聯(lián)信號通路[8]，并增強CaMKⅡ的活性[9]。然而，急性束縛應激是否能通過NE激活β-ARs，對GluA1亞基磷酸化進行調控尚不十分清楚;急性束縛應激對小鼠AMPA受體跨膜轉運以及學習記憶的影響也未見報道。本研究將通過急性束縛建立小鼠應激模型，觀察小鼠學習記憶功能，檢測海馬總蛋白GluA1、pS-831、pS-845、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ以及膜蛋白GluA1的變化，并采用β-ARs阻滯劑普萘洛爾干預，以進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

64只雄性C57BL/6小鼠，8～10周齡，體重20～25 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[合格證號：SCXK（魯）20140007]。所有大鼠置于室溫25℃的動物房適應1周，自由飲食攝水。動物飼養(yǎng)及動物實驗方案遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.2 主要試劑和儀器

鹽酸普萘洛爾片（批號：1704146）購自江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司;GluA1抗體（批號：2955485）購自Millipore公司;GluA1 pS-831抗體（批號：GR46728-15）、GluA1 pS-845抗體（批號：GR246519-11）均購自Abcam公司;CaMKⅡ抗體（批號：E1908）、p-CaMKⅡ抗體（批號：E2013）、β-actin抗體（批號：D0618）均購自Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗（批號：052418181101）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（批號：040818180510）、BCA蛋白測定試劑盒（批號：070517170815）、ECL發(fā)光試劑盒（批號：113016170307）均購自碧云天生物技術有限公司;生物素（EZ-Link sulfo-NHS-SS-Biotin）（批號：NG174 305）、親和素瓊脂糖（批號：ND170336）均購自Thermo Fisher公司。小鼠條件性恐懼檢測箱購自Med Associates公司。

1.3 動物模型的建立

采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為對照組、普萘洛爾組、束縛應激組、聯(lián)合組（束縛應激+普萘洛爾），每組各16只。普萘洛爾組和聯(lián)合組以10 mg/kg普萘洛爾溶液灌胃，同時對照組和束縛應激組以等容積的生理鹽水灌胃，給藥容積均為20 mL/kg。給藥30 min后，束縛應激組和聯(lián)合組小鼠用50 mL EP管束縛，束縛時間為30 min，束縛期間各組小鼠禁水禁食。束縛結束后，各組立即取8只進行行為學檢測，其余8只立即斷頭取腦，提取總蛋白和膜蛋白。

1.4 實驗方法

1.4.1 條件性恐懼記憶實驗? 參照文獻[10]進行，將各組小鼠依次放入條件性恐懼記憶檢測箱體內，箱體四面為黑色背景，總時間為180 s，在150 s時給予聲音30 s（10 kHz，75 dB），在聲音結束時給2 s電刺激（0.7 mA恒流），24 h后，將小鼠放入同一環(huán)境中，記錄小鼠凍結時間。另外將小鼠放入新環(huán)境箱體中，適應30 s后給予聲音30 s，記錄小鼠凍結時間。結果以凍結時間占總觀察時間的百分比表示。

1.4.2 小鼠海馬總蛋白提取? 小鼠海馬取材后，各組隨機取4個海馬組織加入含有PMSF的裂解液，用超聲勻漿器超聲10 s，共4次，間隔40 s。4℃，10 000 g離心10 min，收集上清并測蛋白濃度。按BCA法測定樣本蛋白濃度后，用裂解液和上樣緩沖液將蛋白濃度調為一致。

1.4.3 生物素標記法提取膜蛋白? 參照文獻[11]進行操作，每組剩余的4個海馬組織剪碎后用4℃人工腦脊液（ACSF）洗滌3次，加入1 mL ACSF和40 μL生物素溶液。室溫搖床上孵育30 min后用ACSF洗滌3次，加入含有PMSF的裂解液300 μL，用超聲勻漿器超聲10 s，共4次，間隔40 s。4℃，10 000 g離心10 min，收集上清液并按BCA法測樣本蛋白濃度。測定蛋白濃度后，每管取出相同質量的上清液，加入40 μL親和素瓊脂糖，室溫孵育30 min。4℃ 1000 g離心3 min，取沉淀，用裂解液洗滌沉淀3次后，加入200 μL裂解液和40 μL上樣緩沖液配成小鼠海馬膜蛋白樣品。

1.4.4 免疫印記分析? 等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜。轉移后的PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉1 h后加入適當稀釋的一抗，4℃孵育過夜。用TBST洗膜5 min，共3次，加入相應的二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗膜5 min，共4次，滴加ECL發(fā)光液后，用Bio-rad成像系統(tǒng)檢測，所得條帶使用Image J軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD（方差齊性）或者Dunnett T3（方差不齊），以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠環(huán)境、聲音依賴的凍結時間比較

與對照組比較，束縛應激組小鼠環(huán)境、聲音依賴的凍結時間均增加（P < 0.05）。與束縛應激組比較，聯(lián)合組小鼠環(huán)境、聲音依賴的凍結時間均降低（P < 0.05）。見圖1。

2.2 各組小鼠GluA1亞基在海馬神經(jīng)元細胞膜及總蛋白中的表達比較

與對照組比較，束縛應激組小鼠GluA1亞基在海馬神經(jīng)元細胞膜上的表達（S-GluA1）明顯增加（P < 0.05），GluA1亞基在總蛋白中的表達（T-GluA1）差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與束縛應激組比較，聯(lián)合組小鼠S-GluA1的表達降低（P < 0.05），T-GluA1的表達量差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 各組小鼠海馬GluA1亞基pS-845和pS-831水平比較

與對照組比較，束縛應激組小鼠海馬GluA1亞基pS-845和pS-831水平均提高（P < 0.05）。與束縛應激組比較，聯(lián)合組小鼠海馬GluA1亞基pS-845和pS-831水平均下降（P < 0.05）。見圖3。

2.4 各組小鼠海馬CaMKⅡ和p-CaMKⅡ水平比較

與對照組比較，束縛應激組小鼠海馬p-CaMKⅡ水平升高（P < 0.05），而CaMKⅡ水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與束縛應激組比較，聯(lián)合組小鼠海馬p-CaMKⅡ水平降低（P < 0.05），而CaMKⅡ水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖4。

與對照組比較，*P < 0.05;與束縛應激組比較，#P < 0.05

3 討論

應激對機體的影響是雙重的，過強的應激會引起學習記憶功能的下降，適度應激則能促進學習記憶[1]。本研究結果顯示，束縛應激后的小鼠在環(huán)境和聲音依賴的恐懼記憶測試中表現(xiàn)明顯的凍結時間延長，提示急性束縛應激能增加小鼠的恐懼記憶。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，AMPA受體介導大多數(shù)快速興奮性突觸傳遞[12]。AMPA受體可以快速地插入以及移出突觸后膜，這種動態(tài)轉運方式使其在多種形式的突觸可塑性中發(fā)揮重要作用，并且調控突觸上AMPA受體的數(shù)量可能是誘導LTP的機制之一[13]。含GluA1的受體被募集進入突觸是AMPA受體跨膜轉運的關鍵步驟[6]。本研究結果顯示，束縛應激增加了GluA1亞基細胞膜表面表達量，提示束縛應激在促進AMPA受體跨膜轉運和LTP中發(fā)揮重要作用，AMPA受體是束縛應激影響突觸可塑性的關鍵作用靶點。

GluA1亞基定位到突觸膜上，主要是依靠GluA1亞基Ser-845和Ser-831磷酸化調控的[7]。GluAl亞基Ser-845磷酸化是AMPA受體胞吐到突觸外膜上的關鍵一步[14]。GluA1亞基Ser-831磷酸化，不僅能促使AMPA受體插入突觸后膜，還可以增強其通道傳導性[15]。本研究結果顯示，束縛應激增加GluA1亞基在細胞膜表面表達的同時可以檢測到pS-845和pS-831水平升高，提示束縛應激升高GluA1亞基磷酸化水平，從而影響GluA1亞基在細胞膜表面的表達。

急性應激可以促進藍斑和側腦腦干釋放NE[16-17]，并能投射到海馬等區(qū)域[18]。NE激活海馬β-ARs可以誘導LTP的發(fā)生，發(fā)揮提升學習記憶的作用[3]。本研究結果顯示，普萘洛爾可以阻斷束縛應激對小鼠恐懼記憶的促進作用，并且對束縛應激增強pS-845、pS-831水平以及細胞膜中GluA1亞基的表達也具有阻斷作用。本研究結果提示，β-ARs是束縛應激促進恐懼記憶和GluA1亞基磷酸化以及增加細胞膜上GluA1表達的重要作用靶點之一。

GluA1亞基Ser-845磷酸化是依靠PKA催化的，GluA1亞基Ser-831磷酸化是依靠PKC和CaMKⅡ催化[19]。cAMP-PKA信號級聯(lián)反應是β-ARs的經(jīng)典信號通路，因此束縛應激激活β-ARs后可以進一步激活cAMP-PKA通路，催化GluA1亞基Ser-845磷酸化。然而，束縛應激促進GluA1亞基Ser-831磷酸化的機制尚不明確。在心肌細胞中，兒茶酚胺類物質作用到心肌β-ARs可以激活CaMKⅡ，誘導心肌細胞凋亡[20]。目前，束縛應激激活海馬β-ARs對CaMKⅡ的作用尚鮮見報道。本研究顯示，束縛應激后，小鼠海馬p-CaMKⅡ水平升高，而CaMKⅡ水平無改變;普萘洛爾可以阻斷束縛應激對小鼠海馬p-CaMKⅡ水平的升高作用，而對CaMKⅡ水平無影響。提示束縛應激通過激活β-ARs，促進海馬CaMKⅡ磷酸化從而提升其活性，進一步催化GluA1亞基Ser-831磷酸化。

綜上所述，急性束縛應激可以增強小鼠的恐懼記憶，其可能機制是急性束縛應激促進藍斑和側腦腦干釋放NE并投射到海馬，激活海馬β-ARs，進一步激活PKA和CaMKⅡ，催化GluA1亞基Ser-845、Ser-831磷酸化，促進AMPA受體的跨膜轉運，最終增強小鼠的恐懼記憶。然而，本研究并不能排除其他磷酸化位點的作用。此外，對AMPA受體其他亞基在細胞中的分布也需進一步研究。

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