龔佳夢(mèng)，展 永，耿金鵬，曹天光，秦 壘，李 謹(jǐn)

(1.河北工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津，300401；2.天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津，300384)

隨著空間技術(shù)的發(fā)展，太空誘變育種越發(fā)凸顯其突變譜寬、變異頻率高及育種周期短等優(yōu)勢(shì)。太空環(huán)境為高真空、微重力狀態(tài)，充斥著帶電粒子輻射、太陽(yáng)電磁輻射、空間碎片與微流星體等空間干擾因素[1]，相比地面環(huán)境更加復(fù)雜多變。這些空間因素已被證實(shí)是一種非生物脅迫，會(huì)引起生物體的細(xì)胞染色體、遺傳物質(zhì)DNA及一系列生理生化的變化[2]，其中太空帶電粒子的輻射效應(yīng)一直是育種工作者重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

野生金蓮花作為中藥材需求量日益增大，供不應(yīng)求，而借助太空輻射對(duì)金蓮花進(jìn)行誘變育種是提高其產(chǎn)量、優(yōu)化其品質(zhì)的有效途徑之一，故本研究充分利用我國(guó)“天宮二號(hào)”空間實(shí)驗(yàn)室(以下簡(jiǎn)稱“天宮”)與“神舟十一號(hào)”載人飛船(以下簡(jiǎn)稱“神舟”)同軌對(duì)接的難得機(jī)遇，分別使用二者搭載種質(zhì)相同的金蓮花種子，并結(jié)合隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)，研究了在相同搭載軌道條件下，太空電離輻射的時(shí)長(zhǎng)差異對(duì)金蓮花所受輻射劑量及其基因多態(tài)性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 生物種子及搭載

實(shí)驗(yàn)用野生金蓮花種子由河北美林園林綠化工程有限公司提供，其中搭載“天宮”的種子標(biāo)記為SP2，搭載“神舟”的種子標(biāo)記為SP11，相應(yīng)搭載飛行時(shí)間分別為65天、33天，二者飛行時(shí)長(zhǎng)相差32天。

1.2 太空電離輻射

本文僅分析太空帶電粒子輻射對(duì)飛行器所搭載金蓮花的影響。在低地球軌道空間，帶電粒子輻射主要源于太陽(yáng)粒子事件、銀河宇宙射線以及由地球磁場(chǎng)捕獲的高能電子和質(zhì)子所形成的地球輻射帶[3]。據(jù)中國(guó)科學(xué)院國(guó)家天文臺(tái)太陽(yáng)活動(dòng)預(yù)報(bào)中心數(shù)據(jù)顯示，“天宮”、“神舟”在軌運(yùn)行期間無(wú)太陽(yáng)粒子事件發(fā)生，故無(wú)需考慮該因素對(duì)本研究的影響。此外，由于大氣層和地磁場(chǎng)的保護(hù)作用，近地空間軌道銀河宇宙射線較少，所以該因素對(duì)本研究的影響也可忽略不計(jì)。因此，本研究中金蓮花所受太空帶電粒子輻射主要來(lái)自地球磁場(chǎng)捕獲的高能電子及質(zhì)子。

地球磁場(chǎng)是影響地球輻射帶高能粒子空間強(qiáng)度和分布的決定性因素，其在地球上空1000 km高度以下形成較穩(wěn)定分布。因“天宮”、“神舟”飛行軌道相同，故以近地點(diǎn)382 km和遠(yuǎn)地點(diǎn)391 km為監(jiān)測(cè)點(diǎn)對(duì)飛行軌道地磁場(chǎng)強(qiáng)度進(jìn)行分析。由國(guó)際地磁參考場(chǎng)(IGRF)模型[4]計(jì)算獲得“天宮”、“神舟”運(yùn)行軌道上近地點(diǎn)及遠(yuǎn)地點(diǎn)地球磁場(chǎng)強(qiáng)度分布，再基于地球輻射帶，利用NASA編制的AP-8質(zhì)子模型和AE-8電子模型[4-5]，計(jì)算出飛行器運(yùn)行時(shí)所捕獲帶電粒子的能譜特征。為方便分析，再將“天宮”、“神舟”的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化為由若干層厚度均勻的鋁板組成，設(shè)定每層鋁板厚度為0.1 mm，基于軌道參數(shù)及在軌能譜數(shù)據(jù)，借助Shieldose2模型[6]利用太空輻射分析軟件OMERE5.0計(jì)算出不同厚度鋁板屏蔽后的飛行器艙內(nèi)輻射屏蔽劑量。

1.3 太空搭載金蓮花基因多態(tài)性研究

通過(guò)RAPD分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了SP2以及SP11的DNA分子水平的變化。田間種植SP2、SP11，采集其葉片保存于-80 ℃的冰箱中待用。采用植物基因組DNA提取試劑盒從葉片中提取金蓮花基因組總DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)。

篩選出20種10個(gè)堿基大小的隨機(jī)引物(源自生工生物工程(上海)股份有限公司)用于金蓮花隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增。PCR反應(yīng)使用Golden Easy PCR System試劑盒，反應(yīng)體系計(jì)25 μL，組成為：DNA模板(200 ng/μL)2 μL，2X Reaction Mix(500 μM dNTP each，20 mM Tris-HCl(pH8.3)，100 mM KCl, 3 mM MgCl3，其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑)12.5 μL，Golden DNA Polymerase(2.5 U/μl)0.2 μL，隨機(jī)引物(10 μmol/L)2 μL，滅菌ddH2O 8.3 μL。PCR反應(yīng)在EasyCycler Gradient 96型擴(kuò)增儀上完成，擴(kuò)增程序：94 ℃40 s，94 ℃20 s，35℃ 60 s，72 ℃60 s，45個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)果利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行成像觀察，按照有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得多態(tài)性條帶數(shù)后借助POPGENE32軟件計(jì)算多態(tài)性比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 太空搭載金蓮花所受電離輻射劑量分析

“天宮”、“神舟”運(yùn)行軌道上近地點(diǎn)及遠(yuǎn)地點(diǎn)地球磁場(chǎng)強(qiáng)度分布如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，近地點(diǎn)382 km和遠(yuǎn)地點(diǎn)391 km處地球磁場(chǎng)強(qiáng)度分布范圍分別為19 539.6～51 766.9 nT及19 473.5～51 544.4 nT，因此假設(shè)兩飛行器運(yùn)行軌道上地球磁場(chǎng)強(qiáng)度處處相同。此外，地球磁場(chǎng)強(qiáng)度隨海拔高度的增加而有所減弱，并且南大西洋異常區(qū)的地球磁場(chǎng)強(qiáng)度較同緯度其它地區(qū)明顯偏低?！疤鞂m”與“神舟”對(duì)接組合飛行，飛行軌道經(jīng)過(guò)地球內(nèi)輻射帶邊緣和南大西洋異常區(qū)，在南大西洋異常區(qū)地球磁場(chǎng)呈現(xiàn)負(fù)磁異常，內(nèi)輻射帶在此區(qū)域高度降低，可低至距地面200 km高度處。

(a)近地點(diǎn)

(b)遠(yuǎn)地點(diǎn)

(a)“天宮”

(b)“神舟”

地球輻射帶中的電子和質(zhì)子是“天宮”和“神舟”軌道上主要輻射粒子。高能電子與飛行器屏蔽材料相互作用產(chǎn)生軔致輻射，但軔致輻射劑量低，對(duì)輻射總劑量貢獻(xiàn)較小，由屏蔽產(chǎn)生的次級(jí)輻射和地球輻射帶中電子和質(zhì)子輻射是飛行器艙內(nèi)輻射的主要來(lái)源?；谲壍绤?shù)及在軌能譜數(shù)據(jù)，根據(jù)Shieldose2模型利用太空輻射分析軟件OMERE5.0模擬出“天宮”和“神舟”飛行器內(nèi)輻射屏蔽劑量隨等效鋁板厚度的變化如圖3所示，相應(yīng)計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。由圖3可見(jiàn)，“天宮”和“神舟”艙內(nèi)輻射總劑量、質(zhì)子劑量、電子劑量均隨等效鋁屏蔽厚度的增加而降低；總劑量曲線與被捕獲質(zhì)子劑量曲線隨屏蔽厚度變化趨勢(shì)相近。表1所示計(jì)算結(jié)果表明，當(dāng)?shù)刃тX屏蔽厚度大于13.5 mm時(shí)，兩飛行器艙內(nèi)電子輻射劑量基本為0，此時(shí)二者艙內(nèi)輻射總劑量主要來(lái)源于質(zhì)子輻射劑量。此外，當(dāng)?shù)刃тX屏蔽厚度相同時(shí)，“天宮”艙內(nèi)電子劑量、質(zhì)子劑量、輻射總劑量都大于“神舟”艙內(nèi)相應(yīng)值，這表明在僅考慮地球輻射帶電離輻射且忽略兩飛行器結(jié)構(gòu)和材料差異的前提下，SP2所受輻射總劑量高于SP11相應(yīng)值。

(a)“天宮”

(b)“神舟”

表1 等效鋁厚度與輻射屏蔽劑量

2.2 太空搭載金蓮花基因多態(tài)性分析

20條隨機(jī)引物對(duì)SP2、SP11隨機(jī)擴(kuò)增的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。以SP2為對(duì)照，得到142條穩(wěn)定清晰條帶，大小介于200～3000 bp之間，SP11、SP2二者相對(duì)多態(tài)性比率為36.62%。

表2 RAPD引物擴(kuò)增結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

基于地球輻射帶輻射角度對(duì)航天器所受太空電離輻射進(jìn)行分析，“天宮”與“神舟”運(yùn)行軌道上地球磁場(chǎng)強(qiáng)度分布相同，二者所受輻射劑量主要由質(zhì)子提供，航天器艙內(nèi)屏蔽劑量即搭載金蓮花所接受輻射總劑量，其中“天宮”搭載金蓮花所受輻射總劑量大于“神舟”搭載金蓮花相應(yīng)值，表明在運(yùn)行軌道相同的條件下，飛行器搭載的金蓮花所受太空電離輻射總劑量隨飛行時(shí)間的增加而增大，并且“神舟”搭載金蓮花與“天宮”搭載金蓮花相對(duì)多態(tài)性比率為36.62%，二者基因多態(tài)性呈現(xiàn)出明顯差異。本研究以太空輻射時(shí)長(zhǎng)差異為切入點(diǎn)，所得結(jié)論為太空誘變育種技術(shù)的推廣應(yīng)用提供了參考，同時(shí)太空搭載金蓮花產(chǎn)生的變異植株也為金蓮花新品種的培育提供了新的種質(zhì)資源。