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臺(tái)灣假單胞菌的分離、鑒定及其對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解特性

2019-10-11 10:01李凌凌孫妤婕楊欣月陳容彬左振宇楊忠華
關(guān)鍵詞:氮源碳源生長(zhǎng)量

李凌凌, 楊 進(jìn), 孫妤婕, 楊欣月, 陳容彬, 左振宇,2, 楊忠華,2

(1.武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,湖北 武漢,430081;2.武漢科技大學(xué)煤轉(zhuǎn)化與新型炭材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢,430081)

磷元素是植物生長(zhǎng)過(guò)程中不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)元素之一。目前農(nóng)業(yè)上主要通過(guò)施用化學(xué)肥料來(lái)滿足植物對(duì)磷的需求,但由于土壤的固定作用,施入土壤中的可溶性磷肥會(huì)轉(zhuǎn)化為植物難以吸收利用的無(wú)效態(tài)磷,導(dǎo)致作物對(duì)磷肥的利用率有限[1]。此外,由于耕地長(zhǎng)期施用磷肥,其大部分無(wú)法被農(nóng)作物利用而在土壤中沉積,造成土壤板結(jié)、退化及水體污染,對(duì)生態(tài)環(huán)境帶來(lái)嚴(yán)重危害[2]。

溶磷微生物可以將土壤中富集的難溶性磷溶解為可供植物吸收的可溶性磷,從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育,增加農(nóng)作物產(chǎn)量,改良農(nóng)田土質(zhì)并減少化學(xué)磷肥的投入,而選育出高效且遺傳性能穩(wěn)定的溶磷微生物是實(shí)現(xiàn)微生物肥料活化土壤磷素的前提條件。溶磷微生物的篩選及溶磷能力的提升、微生物肥料的制備及使用效果等一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重要研究方向。目前,研究人員已篩選出大量的溶磷微生物[3-6],如溶磷細(xì)菌(芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬和歐文氏菌屬等)、溶磷放線菌(小單胞菌屬及鏈霉菌屬等)、溶磷真菌(根霉屬、枝孢霉屬、曲霉屬和青霉屬等)。

溶磷菌普遍散布的場(chǎng)合有植物根際、土壤、水體等,而且溶磷菌的分布表現(xiàn)出根際效應(yīng),在玉米、冬小麥等作物根際附近的溶磷菌數(shù)量要明顯高于非根際土壤中的數(shù)量[7],因此篩選溶磷微生物時(shí),植物根際是一種潛在的溶磷菌優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源庫(kù)。本試驗(yàn)從武漢市園林科學(xué)研究所里的植物根際土壤樣品中分離出溶磷菌,進(jìn)行鑒定并研究該菌對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解能力,以期為有效利用土壤中的磷和降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

NBRIP培養(yǎng)基:Ca3(PO4)25.0 g,葡萄糖10.0 g,(NH4)2SO40.15 g,KCl 0.2 g,MgCl2·6H2O 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,加蒸餾水定容至1000 mL,pH值調(diào)至 7.0,用于培養(yǎng)溶磷細(xì)菌[8]。

LB培養(yǎng)基:用于觀察溶磷菌的菌落特征、液體培養(yǎng)特征、運(yùn)動(dòng)性及與氧氣的關(guān)系[9]。

1.1.2 酶和化學(xué)試劑

通用型柱式基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker和2×ES Taq MasterMix(含染料)為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(Cycle-pure kit)為美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品;引物合成和測(cè)序工作由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的篩選

取5 g由武漢市園林科學(xué)研究所的車前草根際處采集的土壤樣品(采集深度5~15 cm),加入到100 mL 的NBRIP液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3~5 d。吸取稀釋度分別為10-4、10-5、10-6的富集培養(yǎng)液0.1 mL,涂布于NBRIP固體培養(yǎng)基中,置于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)72 h后,從平板上挑選具有明顯溶磷圈的菌落,采用平板劃線分離法進(jìn)行菌種純化。每次劃線純化時(shí),用接種環(huán)在上次劃線的末端有較明顯溶磷圈的部分挑取出菌,在新的NBRIP固體培養(yǎng)基上劃線。如此重復(fù)3~4次,直至顯微鏡中觀察到形態(tài)、大小基本一致的細(xì)菌。

1.2.2 溶磷菌溶磷能力的測(cè)定

(1)增溶指數(shù)(solubilization index, SI)

純化好的溶磷菌稀釋涂布接種到NBRIP固體培養(yǎng)基中,于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d后測(cè)量菌株的溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d),根據(jù)SI=D/d計(jì)算細(xì)菌在NBRIP平板上的SI值[10]。

(2)培養(yǎng)液中可溶性磷含量

采用磷釩鉬黃比色法測(cè)定培養(yǎng)液中可溶磷的含量[11]。

1.2.3 溶磷菌的鑒定

(1)菌株的個(gè)體形態(tài)觀察

參照文獻(xiàn)[9]對(duì)溶磷菌進(jìn)行革蘭氏染色。

(2)菌株的生理生化特征

各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的檢測(cè)均按文獻(xiàn)[9]進(jìn)行操作。

(3)系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

按照通用型柱式基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書,提取所選菌株的基因組DNA。菌株的16S rDNA的PCR擴(kuò)增、回收、測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.2.4 溶磷菌對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解條件優(yōu)化

(1)

(2)

式中:m為磷酸根離子占難溶性磷酸鹽的質(zhì)量比。

1.2.5 生長(zhǎng)量、pH及磷溶出量的變化曲線繪制

分別取1 mL處于對(duì)數(shù)期的菌液接入100 mL的NBRIP液體培養(yǎng)基及優(yōu)化后的NBRIP液體培養(yǎng)基中,設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn),放入30 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取一次樣,測(cè)定pH值、OD420和OD600,據(jù)此繪制菌液的pH、磷的溶出量和生長(zhǎng)量隨時(shí)間變化曲線。

1.2.6 菌株對(duì)不同難溶性磷酸鹽的溶解實(shí)驗(yàn)

取1 mL處于對(duì)數(shù)期的菌液接入100 mL含5.0 g/L磷源(分別為Ca3(PO4)2、FePO4、AlPO4、CaHPO4、羥基磷灰石、磷礦粉)的優(yōu)化后NBRIP液體培養(yǎng)基中,在30 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng),48 h取樣測(cè)定pH值和OD420,72 h取樣測(cè)定OD600。

1.2.7 培養(yǎng)液中的有機(jī)酸成分分析

菌株P(guān)2以Ca3(PO4)2、磷礦粉、羥基磷灰石和CaHPO4為磷源的培養(yǎng)液分別經(jīng)離心收集(8000 r/min,15 min)及過(guò)濾(0.45 μm的濾膜)后獲得上清液,使用高效液相色譜儀(安捷倫1100)分析其中的有機(jī)酸成分,色譜柱采用的是SB-C18反相柱,流動(dòng)相為3%甲醇-0.01 mol/L K2HPO4(調(diào)至pH=2.86),流速0.5 mL/min,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm,進(jìn)樣體積5 μL[12]。

1.2.8 菌株對(duì)土壤有效磷含量的影響

采集武漢科技大學(xué)校區(qū)邊的土壤,采樣深度5~20 cm,采集后除雜。將對(duì)數(shù)期的菌液P2(對(duì)照組為10 mL滅活菌液)按照10%的比例與供試土壤混合[13],自然條件下靜置,72 h后采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤中有效磷的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1溶磷菌的篩選

以稀釋涂布的方式將分離純化的菌株接種于NBRIP固體培養(yǎng)基上,5 d后,測(cè)定菌落的直徑和溶磷圈直徑。根據(jù)溶磷圈大小篩選到3株具有溶磷能力的菌株,這些菌株在傳代過(guò)程中能夠穩(wěn)定地保持溶磷性能。其中,菌株P(guān)2的菌落直徑d=2.3 mm,溶磷圈直徑D=4.8 mm(見圖1),計(jì)算得SI=2.08,為同一批次中的最大值,故選擇P2為本研究的出發(fā)菌株。

圖1 菌株P(guān)2的溶磷圈

2.2 溶磷菌P2的鑒定

2.2.1 菌株P(guān)2的個(gè)體形態(tài)特征

在光學(xué)顯微鏡下,菌株P(guān)2為可運(yùn)動(dòng)且不產(chǎn)芽孢的球桿狀細(xì)菌,其革蘭氏染色結(jié)果呈陰性,如圖2所示。

圖2 菌株P(guān)2的革蘭氏染色結(jié)果

2.2.2 菌株P(guān)2的菌落特征

菌株P(guān)2在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后,形成圓形的中心凸起、邊緣不規(guī)則、光滑且濕潤(rùn)的菌落,顏色為乳黃色且不透明。在LB半固體培養(yǎng)基中的穿刺試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株P(guān)2自上到下在穿刺部位的四周呈云霧狀均勻生長(zhǎng),由此可知P2菌兼性好氧,可運(yùn)動(dòng)。

2.2.3 菌株P(guān)2的生理生化特征

如表1所示,菌株P(guān)2的接觸酶、氧化酶及精氨酸雙解酶為陽(yáng)性。菌株P(guān)2能產(chǎn)生胞外的淀粉酶和脂肪酶,但不能產(chǎn)生胞外的明膠酶及尿素酶。菌株P(guān)2可以水解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸生成H2S,但不能還原硝酸鹽生成亞硝酸鹽。IMViC試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株P(guān)2的檸檬酸試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng),即可以利用檸檬酸鹽產(chǎn)生堿性碳酸鹽,使培養(yǎng)基pH值升高從而變成藍(lán)色;但伏普反應(yīng)為陰性,即細(xì)菌不能發(fā)酵葡萄糖生成乙酰甲基甲醇,甲基紅反應(yīng)呈陰性,且菌株P(guān)2也不能產(chǎn)生色氨酸酶分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。在糖酵解試驗(yàn)中,菌株P(guān)2可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣,不能利用蔗糖和乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。另外,在NBRIP液體培養(yǎng)基中,菌株P(guān)2在 30 ℃下生長(zhǎng)狀況最好,40 ℃下可以生長(zhǎng),4 ℃條件下,在光學(xué)顯微鏡中未觀察到菌體P2生長(zhǎng)的跡象。菌體P2最適生長(zhǎng)的pH值為7.0,當(dāng)pH<4.0和pH>10.0時(shí),菌體P2未見生長(zhǎng)。

表1 菌株P(guān)2的生理生化特征

注:+代表陽(yáng)性結(jié)果;-代表陰性結(jié)果;N代表未確定。

2.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以菌株P(guān)2提取出的基因組DNA為模板,進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增,對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖3(a)所示,可見PCR產(chǎn)物位于1000 bp和2000 bp之間,此點(diǎn)與目標(biāo)序列長(zhǎng)度大約為1500 bp相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收獲得的產(chǎn)物(電泳結(jié)果見圖3(b))送交武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,獲得一段長(zhǎng)為1436 bp的核苷酸序列,將此序列提交至Genbank,獲得的登錄號(hào)為MK372541。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的BlastN功能進(jìn)行核苷酸比對(duì),結(jié)果顯示菌株P(guān)2與Pseudomonasputida、Pseudomonasmonteilii及Pseudomonastaiwanensis的16S rDNA基因序列一致性均高達(dá)99%。根據(jù)16S rDNA序列的相似性,利用Clustal Omega和Mega 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖4所示),可見菌株P(guān)2在系統(tǒng)發(fā)育上最接近于臺(tái)灣假單胞菌(Pseudomonastaiwanesis)。

(a) 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 (b) 回收產(chǎn)物

圖3 菌株P(guān)2的16S rDNA PCR擴(kuò)增及回收產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification and purified product from Strain P2

臺(tái)灣假單胞菌[14-15]是球桿狀革蘭氏陰性菌,可以運(yùn)動(dòng),但不能產(chǎn)生芽孢,在TSA培養(yǎng)基上可以長(zhǎng)出濕潤(rùn)的乳黃色圓形菌落。它們可以在5~42 ℃條件下生長(zhǎng),但是不能在更高的溫度(45~60 ℃)下生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度為30~37 ℃。菌株可以在pH=4~9的條件下生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)pH值為6~8。菌株的接觸酶、氧化酶和精氨酸雙解酶檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,但明膠液化反應(yīng)和脲酶檢測(cè)均為陰性。該菌不能產(chǎn)生吲哚,也不能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽及進(jìn)行反硝化作用。文獻(xiàn)[14-15]中描述的臺(tái)灣假單胞菌菌株BCRC 17751T(即菌株CMST和DSM 21245T)的這些特征與菌株P(guān)2的形態(tài)學(xué)、生理生化特征都很接近。綜合16S rDNA鑒定結(jié)果,菌株P(guān)2歸屬于臺(tái)灣假單胞菌(P.taiwanensis)。

2.3 菌株P(guān)2生長(zhǎng)及溶磷條件的單因素優(yōu)化

2.3.1 碳源

溶磷菌P2在不同種類碳源中的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量如圖5(a)所示。以葡萄糖、甘露糖、淀粉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸作為碳源時(shí),溶磷菌P2的生長(zhǎng)量超出對(duì)照組(不接種的相應(yīng)培養(yǎng)基)二倍左右,生長(zhǎng)狀況良好,其中以淀粉為碳源的生長(zhǎng)狀況最好;菌株不能以酪氨酸、甘露醇為碳源生長(zhǎng)。以葡萄糖、甘露糖、乙酸、草酸為碳源時(shí),溶磷菌P2的溶磷率較高,其中以葡萄糖為碳源時(shí)溶磷量最高,為938.14 mg/L,此時(shí)對(duì)應(yīng)的溶磷率為30.61%。當(dāng)以最利于溶磷菌生長(zhǎng)的淀粉作碳源時(shí),卻并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的高溶磷率,推測(cè)是由于以淀粉為碳源時(shí)溶磷菌產(chǎn)酸量不高,這從圖5(a)中pH值可以看出。另外,由溶磷菌P2在不同種類碳源中的pH變化情況可知,溶磷率與pH值存在一定的負(fù)相關(guān)性。

2.3.2 氮源

溶磷菌P2在不同種類氮源中的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量如圖5(b)所示。以尿素為氮源時(shí),溶磷菌P2的生長(zhǎng)濃度最高,其次是以NH4Cl、(NH4)2SO4、草酸銨為氮源,而菌株P(guān)2在酵母抽提物中的生長(zhǎng)濃度最低。以尿素、硝酸鉀、草酸銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨為氮源時(shí),溶磷菌P2的生長(zhǎng)量超出對(duì)照組(不接種的相應(yīng)培養(yǎng)基)二倍左右,生長(zhǎng)狀況良好,但以蛋白胨和酵母抽提物為氮源時(shí)菌體的生長(zhǎng)量較低??傮w來(lái)說(shuō),與有機(jī)氮源比,菌體在無(wú)機(jī)氮源中的生長(zhǎng)狀況較優(yōu)。當(dāng)以氯化銨為氮源時(shí),菌株的溶磷量最高,達(dá)到1131.44 mg/L,對(duì)應(yīng)的溶磷率為36.92%,其次為(NH4)2SO4、草酸銨,這與生長(zhǎng)狀況基本吻合。但是,最適生長(zhǎng)的尿素作氮源時(shí)的溶磷率不是很高,可能與尿素水解生成氨有關(guān)。對(duì)于所研究的幾種氮源,溶磷菌P2在氯化銨中pH值最低,且溶磷率與pH值存在負(fù)相關(guān)性。

2.3.3 碳源濃度

溶磷菌P2在初始碳源(葡萄糖)濃度分別為1、5、10、25、50 g/L條件下的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量如圖5(c)所示。當(dāng)培養(yǎng)基中初始碳源濃度低于25 g/L時(shí),隨著該濃度的增加,溶磷菌P2的生長(zhǎng)量也逐漸增加。當(dāng)初始碳源濃度超過(guò)25 g/L,達(dá)到50 g/L時(shí),溶磷菌P2的生長(zhǎng)量大幅下降。另外,不同初始碳源濃度下的溶磷量變化趨勢(shì)與生長(zhǎng)狀況一致,最適溶磷的初始碳源濃度為25 g/L,此時(shí)溶磷量為1005.16 mg/L,對(duì)應(yīng)的溶磷率為32.80%。培養(yǎng)基初始碳源濃度為25 g/L時(shí)的pH值最低,此時(shí)的溶磷率最高。

圖4 根據(jù)菌株P(guān)2的16S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.4 氮源濃度

溶磷菌P2在初始氮源(NH4Cl)濃度分別為

1—葡萄糖;2—蔗糖;3—木糖;4—麥芽糖;5—甘露糖;6—淀粉;7—酪氨酸;8—甘露醇;9—丁二酸;10—甘油;11—檸檬酸;12—山梨醇;13—肌醇;14—鼠李糖;15—乙酸鈉;16—檸檬酸鈉;17—乙酸;18—草酸;19—草酸銨;

1—尿素;2—蛋白胨;3—KNO3;4—草酸銨;5—NH4Cl

(c)初始碳源(葡萄糖)濃度

6—酵母抽提物;7—NH4NO3;8—(NH4)2SO4

(b)氮源種類

(d)初始氮源(氯化銨)濃度 (e)培養(yǎng)溫度

(f)培養(yǎng)基初始pH值 (g)恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速

圖5 菌株P(guān)2的生長(zhǎng)及溶磷條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Fig.5 Single-factor optimization results of growth and phosphorous-solubilizing conditions of Strain P2

2.3.5 培養(yǎng)溫度

溶磷菌P2在培養(yǎng)溫度分別為4、25、30、37、42 ℃條件下的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量如圖5(e)所示。溶磷菌P2的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。當(dāng)培養(yǎng)溫度高于30 ℃時(shí),隨著溫度升高,溶磷菌P2的生長(zhǎng)量迅速降低。溶磷菌P2的最適溶磷溫度也是30 ℃,此時(shí)溶磷量為855.67 mg/L,對(duì)應(yīng)的溶磷率為27.92%。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)的pH值最低,同樣存在pH值與溶磷率的負(fù)相關(guān)性。

2.3.6 培養(yǎng)基初始pH值

溶磷菌P2在培養(yǎng)基初始pH值為 3~12時(shí)的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量如圖5(f)所示。培養(yǎng)基初始pH值過(guò)低不利于菌株P(guān)2的生長(zhǎng)及溶磷,最適生長(zhǎng)的初始pH值為7。但是,最適合P2溶解磷酸鈣的pH值為5,此時(shí)溶磷量為1092.78 mg/L,對(duì)應(yīng)的溶磷率為35.66%。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值高于10時(shí),P2的溶磷率迅速降低(此時(shí)生長(zhǎng)量也很低),這是因?yàn)槿芰鬃鳛橐粋€(gè)耗酸過(guò)程,當(dāng)P2產(chǎn)生的酸用來(lái)中和環(huán)境中的堿時(shí),用于溶磷的酸量就會(huì)減少,從而導(dǎo)致溶磷率下降。另外,除初始pH值為12的菌液以外,其他菌液的最終pH值都在4左右,說(shuō)明此菌種有一定的環(huán)境改造能力,可通過(guò)自身的代謝過(guò)程調(diào)節(jié)環(huán)境pH值。

2.3.7 恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速

溶磷菌P2在恒溫?fù)u床振蕩器速率為0、100、150、200 r/min條件下的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量如圖5(g)所示。隨著振蕩速率的升高,溶磷菌P2的生長(zhǎng)量和溶磷量均先增大再減少。最適于P2菌生長(zhǎng)和溶磷的搖床轉(zhuǎn)速均為150 r/min,此時(shí)溶磷量為855.67 mg/L,對(duì)應(yīng)的溶磷率為27.92%。靜置時(shí),菌體的生長(zhǎng)停滯,未見pH值和溶磷率的明顯變化,可能是由于此時(shí)磷酸鈣沉降在瓶底,且假單胞菌為好氧微生物,靜置時(shí)菌體很難獲得足夠的氧氣和磷源生長(zhǎng)。當(dāng)振蕩速率較低時(shí),培養(yǎng)液中的溶氧濃度不足,導(dǎo)致菌株的好氧生長(zhǎng)受到抑制,而當(dāng)振蕩速率較高時(shí),磷酸鈣顆粒在振蕩過(guò)程中會(huì)對(duì)菌體產(chǎn)生較大的剪切力,從而影響溶磷率。

2.4 菌株P(guān)2的生長(zhǎng)量及溶磷量隨時(shí)間的變化

經(jīng)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得出最適合P2溶磷的條件為:碳源為葡萄糖、氮源為NH4Cl、初始碳源濃度25 g/L、初始氮源濃度0.15 g/L、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)液初始pH=5、恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速150 r/min。分別配制基礎(chǔ)NBRIP培養(yǎng)基和優(yōu)化后的NBRIP培養(yǎng)基(Ca3(PO4)25.0 g/L,葡萄糖25.0 g/L,NH4Cl 0.15 g/L,KCl 0.2 g/L,MgCl2·6H2O 0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,pH值調(diào)至 5.0),再分別按照1%的接種量接入對(duì)數(shù)期的菌液到兩種培養(yǎng)基中,放入30 ℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣,根據(jù)測(cè)量值繪制菌株P(guān)2在條件優(yōu)化前后的生長(zhǎng)量、菌液pH值和溶磷量隨著時(shí)間變化曲線(見圖6)。從圖6(a)可以看出,條件優(yōu)化前和優(yōu)化后,菌株P(guān)2的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致:0~18 h為延滯期,18~72 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,72 ~120 h為穩(wěn)定期,其中在96 h后生長(zhǎng)量達(dá)到頂峰,培養(yǎng)120 h后進(jìn)入衰亡期。從圖6(b)可以看出,無(wú)論是條件優(yōu)化前還是優(yōu)化后,從接種開始,菌液的pH值均是逐漸下降,直到18 h后,菌液pH值開始穩(wěn)定。推測(cè)是由于菌體溶解Ca3(PO4)2是一個(gè)耗酸的過(guò)程,同時(shí)菌體發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸,在前18 h產(chǎn)酸量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于耗酸量,pH值迅速降低,但當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期后,產(chǎn)酸與耗酸達(dá)到平衡,pH值基本保持穩(wěn)定。從圖6(c)中可以看出,無(wú)論是條件優(yōu)化前還是優(yōu)化后,菌株P(guān)2培養(yǎng)至48 h后,培養(yǎng)基中可溶性磷含量趨于穩(wěn)定,優(yōu)化前最大溶磷率為29.02%(對(duì)應(yīng)的溶磷量為889.18 mg/L),優(yōu)化后的最大溶磷率為41.37%(溶磷量為1267.89 mg/L),約為優(yōu)化前的1.43倍。

(a)生長(zhǎng)量

(b)pH值

(c) 溶磷量

圖6 條件優(yōu)化前后菌株P(guān)2的生長(zhǎng)量、pH值及溶磷量隨時(shí)間變化曲線

Fig.6 Variations of growth, pH and phosphorous-solubilizing capacity of Strain P2 with time under optimized and non-optimized conditions

2.5 菌株P(guān)2對(duì)多種難溶性磷酸鹽的溶解

難溶性磷會(huì)在石灰性土壤中轉(zhuǎn)化為磷酸鈣,在酸性土壤中轉(zhuǎn)化成磷酸鐵和磷酸鋁,溶磷微生物可以將這些難溶性磷轉(zhuǎn)化成植物可以吸收利用的磷。為進(jìn)一步了解菌株P(guān)2適合施加的土壤類型,本文考察了溶磷菌P2在不同種類磷源中的生長(zhǎng)量和溶磷率變化情況,結(jié)果如表2所示。以CaHPO4、羥基磷灰石、磷礦粉、Ca3(PO4)2作為磷源時(shí),P2的生長(zhǎng)狀況較好,其中以CaHPO4為磷源的生長(zhǎng)狀況最好;以AlPO4、FePO4為磷源時(shí),菌體生長(zhǎng)較差。以CaHPO4、Ca3(PO4)2、羥基磷灰石作磷源時(shí),溶磷菌P2的溶磷率較高,而其對(duì)磷礦粉、AlPO4、FePO4的溶磷率較低。Bashan等[16]認(rèn)為,在篩選適合酸性土壤的溶磷微生物時(shí),應(yīng)以Al-P和Fe-P化合物作為磷源,而篩選適合堿性土壤的溶磷微生物時(shí),應(yīng)添加Ca-P型磷源。溶磷菌P2對(duì)CaHPO4、Ca3(PO4)2、羥基磷灰石的溶磷效果要優(yōu)于對(duì)AlPO4、FePO4的溶磷效果,表明其更適合于施加到偏堿性土壤中。

表2 菌株P(guān)2對(duì)不同難溶性磷酸鹽的溶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

假單胞菌屬是土壤中篩選出的主要溶磷微生物之一,很多研究報(bào)道都顯示假單胞桿菌屬菌株對(duì)難溶性磷酸鹽具有較好的溶磷效果。孫珊等[17]篩選的一株假單胞菌屬菌株GJT-1對(duì)磷酸鈣和宜昌磷礦粉的溶磷量可分別達(dá)到224.51 mg/L和120.59 mg/L。劉輝等[18]篩選的一株熒光假單胞菌JW-JS1對(duì)磷酸鈣的溶磷量最高可達(dá)到708.34 mg/L。郭瑩等[19]研究的銅綠假單胞菌JM1對(duì)磷酸鈣和磷酸鋁的溶磷量分別為240.63 mg/L和92.73 mg/L。本研究篩選得到的臺(tái)灣假單胞菌P2對(duì)這些難溶性磷酸鹽的溶解能力與上述報(bào)道的數(shù)據(jù)相當(dāng),甚至更優(yōu)。

2.6 菌株P(guān)2對(duì)難溶性磷酸鹽的溶出液中有機(jī)酸分析

溶磷微生物溶解土壤中難溶性磷酸鹽的機(jī)制與微生物分泌的有機(jī)酸有關(guān)。這些有機(jī)酸不僅可以降低環(huán)境的pH值,使得磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵等溶解,而且能與難溶性磷酸鹽中的鋁、鈣、鐵、鎂等金屬離子螯合,釋放出磷酸根離子[12,20-21]。通過(guò)高效液相色譜儀得出的菌株P(guān)2對(duì)難溶性磷酸鹽的溶出液中有機(jī)酸分析結(jié)果如圖7所示。比較以不同難溶性磷酸鹽為磷源的培養(yǎng)液中總有機(jī)酸濃度(見表3),按濃度高低排序如下:羥基磷灰石>磷酸氫鈣>磷酸鈣>磷礦粉。

(a) 磷酸氫鈣

(b) 羥基磷灰石

(c)磷酸鈣

(d) 磷礦粉

難溶性磷酸鹽種類葡萄糖醛酸草酸酒石酸蘋果酸乙酸檸檬酸琥珀酸總有機(jī)酸磷酸氫鈣5.94—22.81425.02——440.32894.09羥基磷灰石—27.85—256.47178.43—483.72946.47磷酸鈣8.19——27.08—478.21—513.48磷礦粉7.125.489.59—14.439.014.4860.10

對(duì)比表2和表3可知,磷的溶出率與總有機(jī)酸濃度之間總體存在正相關(guān)性,再次表明難溶性磷酸鹽的溶解是一個(gè)依賴于酸的過(guò)程。

2.7 菌株P(guān)2對(duì)土壤有效磷含量的影響

為了檢驗(yàn)菌株P(guān)2是否能夠轉(zhuǎn)化土壤中難溶性磷酸鹽而改善土壤的供磷能力,將菌液按照10%的比例與供試土壤混合。經(jīng)過(guò)3 d后,土壤中的有效磷含量從最初的8.63 mg/kg上升為12.66 mg/kg。由此可知,最初的土壤有效磷含量較低,屬于低能力供磷水平,而施加菌株P(guān)2后,土壤有效磷含量提高,達(dá)到中等供磷水平,表明菌株P(guān)2能夠改善土壤的供磷水平。

3 結(jié)論

(1)從武漢市園林科學(xué)研究所的車前草根際采集的土樣中分離得到了一株具有溶磷能力的臺(tái)灣假單胞菌P2。

(2)經(jīng)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得出最適合P2溶磷的條件為:碳源為葡萄糖、氮源為NH4Cl、初始碳源濃度25 g/L、初始氮源濃度0.15 g/L、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)液初始pH值為5、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。優(yōu)化條件后菌株P(guān)2的溶磷率可以達(dá)到41.37%,約為優(yōu)化前的1.43倍。

(3)溶磷菌P2對(duì)多種難溶性磷酸鹽均有一定的溶解能力,且對(duì)Ca3(PO4)2、CaHPO4、羥基磷灰石等Ca-P型磷源的溶磷效果要優(yōu)于對(duì)AlPO4、FePO4的溶磷效果,即菌株P(guān)2適合于溶解石灰性土壤中的磷。

(4)磷的溶出是一個(gè)耗酸的過(guò)程,磷的溶出率與培養(yǎng)液中總有機(jī)酸濃度之間存在正相關(guān)性。

(5)菌株P(guān)2可以提高土壤的有效磷含量,明顯改善土壤的供磷水平,具有良好的微生物肥料應(yīng)用前景。

Isolation,identificationofPseudomonastaiwanesisanditsbio-solubilizationofinsolublephosphates

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