張文興, 李嘉懿

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院普外科,湖南 長沙 410007;2.湖南中醫(yī)藥大學附屬岳陽醫(yī)院普外科,湖南 岳陽 410000

膽囊癌(Gallbladder carcinoma,GBC)是一種最常見的膽系惡性腫瘤,以起病隱匿、早期診斷難、惡性程度高、早期易轉(zhuǎn)移等為主要臨床特點,嚴重威脅人類健康[1,2].而目前國內(nèi)外對膽囊癌的診斷和治療仍無突破性進展,以手術(shù)為主的治療方案對中晚期膽囊癌效果欠佳,術(shù)后5年生存率低,需術(shù)后輔助化療[3,4].但目前膽囊癌化療敏感度不高、副作用大,因此尋找安全、更有效的抗癌藥物對膽囊癌的輔助治療意義重大,中醫(yī)藥資源、天然植物抗腫瘤藥物成分提供了新思路.現(xiàn)代藥理研究證實,從虎杖、葡萄中提取的抗腫瘤物質(zhì)--白藜蘆醇(RES)可抑制膽囊癌細胞生長,并可誘導細胞凋亡[5].利用白蛋白納米載藥技術(shù)改善白藜蘆醇難溶于水、生物利用度低的化學性質(zhì),本研究制備了白藜蘆醇白蛋白納米顆粒(RES-BSANP),對比RES及其白蛋白納米制劑的生物利用度及探討其對人膽囊癌細胞GBC-SD細胞的體外抗腫瘤作用.

1 資料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)方法

選擇人膽囊低分化腺癌細胞系GBC-SD為受體細胞,在37℃、5%CO2及飽和濕度下,含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),細胞呈單層貼壁生長,每周傳代2~3次.

1.2 主要材料

白藜蘆醇白蛋白納米粒(由湘雅醫(yī)學院肝膽腸納米實驗室提供)、98%白藜蘆醇、5-Fu、BSA FractionV、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物、細胞增殖與毒性檢測試劑盒.高速離心機、凈化工作臺、超微量分光光度計、電泳儀、PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標儀、CO2培養(yǎng)箱、單通道移液器、微量移液器.

1.3 CCK-8檢測細胞增殖抑制率

細胞增殖與毒性檢測試劑盒4℃避光保存.收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,每孔加入100 ul,鋪板,緩沖液填充邊緣.CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給藥干預(yù).通過查閱相關(guān)文獻[6]確定分組方法:根據(jù)干預(yù)藥物(5-Fu、白藜蘆醇、白藜蘆醇白蛋白納米粒)濃度設(shè)置10、20、40、80 μg/mL 5個藥物濃度組,并設(shè)置GBC-SD細胞空白對照組及空白納米粒組,每組各5重復孔.按實驗需要,5%CO2,37℃培養(yǎng)48 h.每孔加入10 ul試劑盒中7sea-cell counting kit溶液,同步設(shè)調(diào)零孔.繼續(xù)培養(yǎng)2h.用酶標儀檢測得OD450.記錄結(jié)果并繪制曲線圖,計算細胞增殖抑制率,細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)X100%.

1.4 RT-PCR檢測細胞Caspase-3;Caspase-8;Caspase-9 mRNA表達

收集對數(shù)生長期腫瘤細胞,以3X104個/孔接種于孔板中,同1.5分組,藥物組根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果取1/2 LC50(40 μg/mL)進行實驗.根據(jù)RT-PCR法行總RNA提取、引物設(shè)計、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、擴增,并使用bio-rad自帶軟件Image Lab分析得到目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度值比值,比較對照組和用藥組Caspase-3;Caspase-8;Caspase-9 mRNA基因表達的異同.

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理,多組計量資料比較采用單因素方差分析,組間多重比較如方差齊采用LSD檢驗,如方差不齊采用Dunnett T3檢驗.P<0.05表示有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測GBC-SD細胞增殖率

以空白組、空白納米粒及三種不同濃度的藥物組分別處理細胞48 h,CCK-8法測定各組對膽囊癌GBC-SD細胞的生長抑制作用.擬定空白對照組對膽囊癌細胞增殖抑制率為0%,結(jié)果顯示空白納米粒組對GBC-SD細胞的生長基本無抑制作用,提示空白納米粒對GBC-SD細胞生長無影響,可排除白蛋白納米粒對GBC-SD細胞的影響.而三種藥物組在10~80 μg/ml濃度區(qū)間對GBC-SD細胞的生長有抑制作用,且呈一定的濃度依賴性.比較同濃度下不同藥物對膽囊癌細胞的增殖抑制率,結(jié)果顯示當藥物濃度為10 μg/ml及20 μg/ml時,三組之間細胞抑制率無統(tǒng)計學意義(P>0.05);藥物濃度為 40 μg/ml時 ,RES-BSANP>5Fu、 RES(P<0.05),藥物濃度為80 ug/ml時,5Fu、RES-BSANP>RES(P<0.05),見圖1.

圖1 各組藥物在不同濃度下對GBC-SD細胞的細胞增殖的抑制率

2.2 RT-PCR檢測Caspase-3/8/9mRNA表達的結(jié)果

藥物組取40 μg/μl作為實驗終濃度,應(yīng)用biorad自帶軟件Image Lab分析得到目的條帶與內(nèi)參條帶的光密度值比值,見圖2.空白對照及空白納米粒組間各值比較無統(tǒng)計學意義;5-Fu組、RES組及RES-BSANP組同空白對照、空白納米粒組相比,各藥物組作用的細胞中細胞內(nèi)Caspase-3/8/9mRNA相對表達量均有不同程度的上調(diào),即RES能通過上調(diào)Caspase家族相關(guān)凋亡基因,從而促進膽囊癌細胞凋亡,抑制膽囊癌細胞的增殖.

圖2 不同濃度下的3種藥物對GBC-SD細胞增殖抑制率的影響

圖3 各組作用于膽囊癌細胞后對Caspase-3/8/9 mRNA電泳圖

3 討論

白藜蘆醇(RES)是一種存在于葡萄科、蓼科等植物(如虎杖、葡萄)中的抗毒素,因其在防治腫瘤、心血管疾病及調(diào)節(jié)免疫等方面的巨大潛力,其藥理活性的研究逐漸得到關(guān)注[7].近期研究表明,RES作為癌化學預(yù)防劑,能針對多種如消化道、泌尿生殖及神經(jīng)系統(tǒng)等不同類型的腫瘤細胞起到抑制作用[8,9].研究表明,RES能夠激活Caspase-8或9,從而引發(fā)Caspase蛋白聯(lián)級反應(yīng),并進一步活化下游共同效應(yīng)分子Caspase-3,通過外源或內(nèi)源性途徑促進某些腫瘤細胞的凋亡,如鼻咽癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤[9,10].但國內(nèi)外針對RES作用于膽囊癌的研究較少,勝利等[7]表明,RES能將能通過誘導GBC-SD細胞凋亡而抑制其增殖,可能與GBC-SD細胞中G0/G1阻滯、抑凋亡基因Bcl-2、cmyc基因蛋白下降,抑癌基因P53基因蛋白表達增強有關(guān).

本研究通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn),在20、40、80 μmol/L濃度時RES-BSANP組對膽囊癌GBC-SD的抑制作用較RES明顯增強,并在10~80 μmol/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯濃度依賴性.考慮5-Fu作為膽囊癌化療方案中的用藥基礎(chǔ)(如FAM)[5],本文另設(shè)5-Fu作為陽性藥物對照組.CCK-8實驗結(jié)果顯示RES-BSANP與5-Fu組在小于等于40 μmol/L時,RES-BSANP組膽囊癌GBC-SD的抑制率大于5-Fu組,在80 μmol/L其抑制率呈反轉(zhuǎn),但該差異并無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05).RT-PCR實驗中5-Fu組在Caspase-3 mRNA中表現(xiàn)為更顯著的表達量(P<0.05).其原因可能與本實驗濃度范圍設(shè)置過窄所致,當濃度大于80 μmol/L,5-Fu組膽囊癌GBC-SD的抑制率可能大于RES-BSANP組,而對于凋亡基因Caspase表達可能更加顯著,兩者均能通過上調(diào)Caspase家族相關(guān)凋亡基因Caspase-3/8/9的表達,從而促進膽囊癌細胞凋亡,抑制膽囊癌細胞的增殖.

4 結(jié)論

本文以RES為模型藥物,通過體外抗腫瘤實驗表明,RES-BSANP對膽囊癌細胞株增殖有明顯的抑制作用,且其抑制作用相當于5-FU,這種作用機制可能與誘導促凋亡基因Caspase-3/8/9的表達有關(guān).