謝細(xì)琴, 韓甜甜, 林麗珠, 周京旭

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405

結(jié)直腸癌(Coloretal carcinoma,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因.研究發(fā)現(xiàn),有20%~40%的CRC患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移[1];另外50%的CRC患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生在根治術(shù)后;死于腸癌的患者中發(fā)生肝轉(zhuǎn)移者占45%~71%[2].防治腫瘤轉(zhuǎn)移是治療結(jié)直腸癌的關(guān)鍵.近10余年來出現(xiàn)的"腫瘤干細(xì)胞學(xué)說"認(rèn)為,腫瘤組織中存在少數(shù)的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC),它們具有與正常干細(xì)胞相似的特性,能不斷自我更新和分化,是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥的根源[3].已有文獻(xiàn)報(bào)道,白血病、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤中確實(shí)存在腫瘤干細(xì)胞[4].研究腫瘤干細(xì)胞有可能為防治腫瘤轉(zhuǎn)移找到新的突破口.槐耳清膏具有抗癌普廣、抑瘤效果較明顯、藥效穩(wěn)定、無明顯藥物毒性等特點(diǎn)而廣泛用于臨床,且槐耳清膏具有較強(qiáng)的抑制腫瘤生長作用.本研究通過無血清有限稀釋法分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)腸癌CSC,觀察分析腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)特性,為進(jìn)一步研究結(jié)腸癌CSC提供基礎(chǔ).通過槐耳清膏及氟尿嘧啶對腫瘤干細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)了解腫瘤干細(xì)胞的耐藥性及干預(yù)效果.

1 材料和主要篩選方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫.

1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司,0.25%胰酶-EDTA、Accutase購自美國eBioscience公司,白血病抑制因子(LIF)、重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)、重組人表皮生長因子(EGF)均購自美國PeproTech公司,B27購自美國Invitrogen公司,細(xì)胞周期試劑盒購自美國Beckman公司,Anti-CD133、Anti-CD44均購自美國eBioscience公司,普通96孔和6孔板、超低粘附培養(yǎng)板(6孔)均購自美國Corning公司.無血清培養(yǎng)基(serum-free medium,SFM):EGF(20 ng/ml)、bFG(10 ng/ml)、B27(1∶50)、LIF(10 ng/ml)、DMEM/F12(1∶1)、雙抗(1∶100).

1.3 細(xì)胞克隆球的篩選及培養(yǎng)

取對數(shù)生長期的HCT116貼壁細(xì)胞,用胰酶消化置備成單細(xì)胞懸液,加PBS洗滌,離心棄上清后以SFM重懸并稀釋至10個(gè)/ml,以100 ul/孔接種于96普通孔板中.2~3天后鏡下觀察各孔中的細(xì)胞,記錄目標(biāo)孔(只有1~3個(gè)細(xì)胞的孔),并將目標(biāo)孔中的SFM加滿至200 ul.10~12天后鏡下觀察并記錄目標(biāo)孔中形成克隆球情況,將體積較大、長勢較好的細(xì)胞球轉(zhuǎn)入超低粘附培養(yǎng)板中,加SFM繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長大至小米粒大小,予Accutase消化的細(xì)胞懸液,繼續(xù)擴(kuò)大傳代培養(yǎng).同時(shí)鏡下動態(tài)觀察換用SSM培養(yǎng)的細(xì)胞球的形態(tài)變化.

1.4 槐耳清膏的制備

采用固體發(fā)酵新工藝,將槐栓菌菌種在發(fā)酵基質(zhì)上發(fā)酵,形成含有槐耳菌絲體多糖等活性成分的槐耳菌質(zhì).槐耳菌質(zhì)再采用熱水、乙醇等提取清膏[5].

2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和CSC相關(guān)標(biāo)志物CD133、CD44

2.1 檢測CSC相關(guān)標(biāo)志物 分別置備HCT116細(xì)胞和干細(xì)胞克隆球單細(xì)胞懸液,將抗體與細(xì)胞懸液以5 ul∶100 ul混合均勻,避光孵育15分鐘,PBS洗1遍后再加500 ulPBS重懸,上流式細(xì)胞儀檢測.2.2 檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞和干細(xì)胞克隆球分別置成單細(xì)胞懸液,離心后加PBS重懸,向重懸液中加入細(xì)胞周期檢測液,避光孵育30 min,過200目尼龍篩后上流式細(xì)胞儀檢測分析.

3 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

取高溫高壓滅菌后的瓊脂糖粉,用基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別制備1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的瓊脂糖液體培養(yǎng)基,將0.7%的瓊脂糖置38℃水浴以維持其液體狀態(tài)的同時(shí),取1.2%瓊脂糖以2 ml/孔平鋪于6孔板底層,待其凝固后,將置備好的細(xì)胞懸液與0.7%瓊脂糖均勻后加至底層瓊脂糖上層,待凝固后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)15天.鏡下觀察軟瓊脂中形成的細(xì)胞球,經(jīng)吉姆薩染液染色后,鏡下記錄細(xì)胞克隆球個(gè)數(shù),并計(jì)算克隆形成率(克隆球形成率=形成克隆球數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)Xl00%),重復(fù)3次.

4 氟尿嘧啶、槐耳清膏對腫瘤干細(xì)胞的干預(yù)實(shí)驗(yàn)

置備同濃度(105/ml)的HCT116及腫瘤干細(xì)胞懸液,以100 ul/孔接種于96孔板(第一列孔不接種細(xì)胞,加入相同體積的DMEM高糖培養(yǎng)基)后置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí).同時(shí)配置各濃度梯度的槐耳清膏液和氟尿嘧啶液(具體濃度梯度見表1、表2),封口標(biāo)記后置于4℃冰箱內(nèi)備用.24小時(shí)后取出96孔板,吸盡每孔中的培養(yǎng)液后,以每組8個(gè)復(fù)孔、每孔100 ul向有細(xì)胞的孔內(nèi)加入各濃度梯度的藥液,做好標(biāo)記后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)72小時(shí).以DMEM:CCK-8=10:1配置檢測液,72小時(shí)后從培養(yǎng)箱內(nèi)取出96孔板,吸盡培養(yǎng)液,以每孔100 ul加入檢測液.待各組出現(xiàn)明顯顏色差異時(shí)上酶標(biāo)儀檢測OD值,記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率.細(xì)胞抑制率=(OD對照組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(OD對照組-OD空白組)X100%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并畫出相應(yīng)的濃度-抑制率曲線.

表1 槐耳清膏配置濃度梯度(單位:mg/ml)

表2 氟尿嘧啶配置濃度梯度(單位:um/L)

5 結(jié)果

5.1 結(jié)腸癌干細(xì)胞球的篩選

共計(jì)接種96孔板2塊(約200個(gè)孔,400個(gè)細(xì)胞),經(jīng)無血清培養(yǎng)共獲得HCT116單細(xì)胞源性腫瘤干細(xì)胞克隆球14個(gè)(依次編號為1~14),記錄僅接種1~3個(gè)細(xì)胞/孔的孔有49個(gè),腫瘤干細(xì)胞球克隆形成率約為28.6%(14/49),部分細(xì)胞呈貼壁生長,或是不能耐受無血清培養(yǎng)環(huán)境而死亡崩解.獲得的腫瘤細(xì)胞球在無血清培養(yǎng)基、低粘附培養(yǎng)板中為懸浮生長,克隆球外觀圓潤,無明顯突起,球中的細(xì)胞呈圓形,細(xì)胞間排列緊湊,不能區(qū)分細(xì)胞間界限,球內(nèi)折光性良好;將克隆球細(xì)胞離散后再接種于96孔板,細(xì)胞表現(xiàn)出快速生長、更易成球的特點(diǎn),成球率高達(dá)43.2%(32/74).隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,腫瘤細(xì)胞形成的克隆球體積增大,細(xì)胞數(shù)量快速增多,體現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞快速增殖特性,如圖1示.

5.2 結(jié)腸癌干細(xì)胞球的培養(yǎng)

圖1 腫瘤細(xì)胞克隆球形成

用無血清培養(yǎng)基超低粘附培養(yǎng)板培養(yǎng)結(jié)腸癌干細(xì)胞球,細(xì)胞球增殖迅速,且將細(xì)胞球離散為細(xì)胞懸液后很快形成大量細(xì)胞球,如圖2示.

圖2 克隆球擴(kuò)大培養(yǎng)

5.3 腫瘤干細(xì)胞球再分化實(shí)驗(yàn)

將無血清培養(yǎng)篩得的細(xì)胞克隆球轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(SSM)中培養(yǎng),可見克隆球周邊細(xì)胞逐漸游離出細(xì)胞球,并且重新貼壁分化,由球形變?yōu)槎趟笮?、無規(guī)則片狀,形態(tài)與含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT116相似,隨著含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間延長,克隆球中部細(xì)胞也逐漸游離出克隆球并貼壁分化,形成單層細(xì)胞,如圖3示.

5.4 流式細(xì)胞分選儀檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44

采用流式細(xì)胞分選儀檢測腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物顯示,HCT116中有87.97%的細(xì)胞表達(dá)CD133+CD44+,克隆球細(xì)胞中93.87%的細(xì)胞表達(dá)CD133+CD44+,表明HCT116細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞所占比例較高.

5.5 流式細(xì)胞分選儀檢測細(xì)胞周期

圖3 克隆球再分化

圖4 腫瘤細(xì)胞周期

采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期,如下圖4所示,經(jīng)無血清培養(yǎng)基篩選獲得的結(jié)直腸腫瘤干細(xì).6.2胞中77.18%處于G0-G1期,而含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的HCT116貼壁細(xì)胞中49.0%處于G0-G1期.這表明腫瘤干細(xì)胞群與一般的腫瘤細(xì)胞群周期特點(diǎn)有所不同.在腫瘤干細(xì)胞群中,少數(shù)細(xì)胞處于細(xì)胞周期中活躍的增殖期,多數(shù)細(xì)胞則處于相對靜止的GO、G1期.這一結(jié)果與腫瘤干細(xì)胞的理論相符,即腫瘤細(xì)胞的增殖能力各不相同,大部分腫瘤細(xì)胞活躍在動態(tài)的細(xì)胞周期,僅有少部分細(xì)胞如腫瘤干細(xì)胞處于相對靜止階段.

5.6 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)

肉眼及鏡下均見細(xì)胞克隆球在軟瓊脂半固體培養(yǎng)基中形成,如圖5示.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明,三組細(xì)胞的總體差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單因素方差分析結(jié)果顯示,與HCT116細(xì)胞比較,接種相同數(shù)量的腫瘤干細(xì)胞后,克隆球1和克隆球2所形成的細(xì)胞克隆球數(shù)量均顯著較HCT116細(xì)胞多,2個(gè)克隆球的集落形成率(51.97%和39.54%)與HCT116細(xì)胞集落形成率(5.67%)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,如表3示.

圖5 軟瓊脂集中克隆球形成

表3 腫瘤干細(xì)胞、HCT116細(xì)胞克隆球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

5.7 細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

予藥液培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞后,均出現(xiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞生長被抑制情況,且隨著用藥濃度的升高,腫瘤細(xì)胞生長抑制率隨之增大.用藥后藥物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率如圖6示.槐耳清膏組中,用較低濃度藥物培養(yǎng)細(xì)胞后,HCT116細(xì)胞生長被抑制的影響不明顯,其生長抑制率波動在8%左右,而對應(yīng)在相同用藥濃度下的腫瘤干細(xì)胞克隆球出現(xiàn)了較明顯的生長抑制,其生長抑制率波動在60%左右;但是隨著槐耳清膏用藥濃度的增高,HCT116細(xì)胞生長抑制率隨之迅速升高,當(dāng)槐耳清膏用藥濃度達(dá)到250 mg/ml時(shí),HCT116細(xì)胞生長抑制率高達(dá)90.0%;對應(yīng)的腫瘤干細(xì)胞克隆球的生長抑制率隨槐耳清膏用藥濃度的升高變化幅度不是很大,其生長抑制率波動在77.0%左右,當(dāng)槐耳清膏用藥濃度達(dá)到250 mg/ml時(shí),腫瘤干細(xì)胞克隆球的生長抑制率為77.6%;與HCT116細(xì)胞比較,腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出對槐耳清膏有耐藥趨勢.氟尿嘧啶組中,HCT116細(xì)胞在較低用藥濃度時(shí)即出現(xiàn)了較高的生長抑制率(65.4%),而相對應(yīng)的腫瘤干細(xì)胞克隆球的生長抑制率較低(17.0%),當(dāng)氟尿嘧啶用藥濃度達(dá)到80 um/L時(shí),HCT116細(xì)胞的生長抑制率高達(dá)83.6%,而在相同用藥濃度下,對腫瘤干細(xì)胞克隆球的生長抑制率僅為54.4%;與HCT116細(xì)胞比較,腫瘤干細(xì)胞表現(xiàn)出對氟尿嘧啶有明顯的耐藥趨勢.分析比較HCT116細(xì)胞組,氟尿嘧啶對其生長抑制作用較槐耳清膏作用出現(xiàn)得較快,但氟尿嘧啶最終對HCT116細(xì)胞的生長抑制率較槐耳清膏低(83.6%vs.90.0%);對于腫瘤干細(xì)胞組,在相同濃度下,槐耳清膏作用后對腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的抑制較氟尿嘧啶的明顯較強(qiáng),且槐耳清膏最終對腫瘤干細(xì)胞的生長抑制率較氟尿嘧啶高(77.6%vs.54.4%).

圖6 用藥后72小時(shí)細(xì)胞增殖抑制率曲線圖

6 討論

目前用于分離腫瘤干細(xì)胞的方法主要有利用腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞儀分選法或免疫磁珠分選法[6]、克隆培養(yǎng)法[7]、耐藥篩選法[8]及無血清培養(yǎng)等[9],各種方法均有其特點(diǎn),也有其局限性.有文獻(xiàn)提出,運(yùn)用流式或免疫磁珠分選法得到的細(xì)胞數(shù)量太少而不利于擴(kuò)大培養(yǎng),而SP細(xì)胞經(jīng)Hoechst 33342染色篩選過程中,染料毒性會影響其成瘤性.相對而言,無血清培養(yǎng)法可以獲得穩(wěn)定擴(kuò)大培養(yǎng)的腫瘤干細(xì)胞,同時(shí)不影響其成瘤性.無血清懸浮培養(yǎng)法是將較低濃度的原代貼壁細(xì)胞懸液置于超低粘附培養(yǎng)板,通過SFM培養(yǎng)獲得細(xì)胞克隆球,再經(jīng)多次傳代培養(yǎng)以獲得穩(wěn)定成球的腫瘤干細(xì)胞過程[10].

腫瘤干細(xì)胞的分離方法多樣,形式可以靈活多變.鄧艷紅等[11]運(yùn)用磁珠分選結(jié)合無血清有限稀釋法篩選出CD133+的結(jié)腸癌細(xì)胞,并提出了腫瘤干細(xì)胞對傳統(tǒng)化療藥物耐藥的假設(shè).王媛媛等[12]結(jié)合免疫磁珠和流式細(xì)胞儀分選法篩選出6種腸癌細(xì)胞株中CD133+的腫瘤干細(xì)胞.方仕等[13]通過由完全培養(yǎng)基逐步過渡至無血清培養(yǎng)基(無生長因子)培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620,篩出腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,進(jìn)而研究證明n-3多不飽和脂肪酸對結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞具有抗增殖作用.賈健鋒等[14]利用無血清培養(yǎng)基(添加生長因子EGF、Noggin、RSpondin 1)培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620、LOVO、HT29和HCT116,研究培養(yǎng)得細(xì)胞球的干性相關(guān)特征.劉美等[15]通過比較3種方法(單純無血清懸浮培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑、無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑+流式細(xì)胞術(shù))富集人結(jié)腸癌細(xì)胞株CW-2干細(xì)胞細(xì)胞得出,無血清懸浮培養(yǎng)+奧沙利鉑+流式細(xì)胞術(shù)的多重聯(lián)合富集法較其他兩種方法較好,可以篩得更多的腫瘤干細(xì)胞.本研究是在無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,采用有限稀釋法篩取腫瘤干細(xì)胞.無血清有限稀釋法是通過將原代貼壁細(xì)胞稀釋至超低濃度(10個(gè)/ml),然后接種入普通96孔板SFM培養(yǎng),獲得的克隆球繼續(xù)于超低粘附培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)的一種方法.這種有限稀釋法法雖不能保證96孔板中每個(gè)孔都有或只有1個(gè)細(xì)胞,但是可以保證每個(gè)孔中形成的細(xì)胞球數(shù)量極有限(一般1~3個(gè)),可以盡量避免細(xì)胞球間的互相融合而至單個(gè)細(xì)胞球并非來至于1個(gè)腫瘤細(xì)胞;而最初用普通96孔板可以誘導(dǎo)有分化趨勢的細(xì)胞分化,淘汰這部分處于貼壁細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞臨界狀態(tài)的細(xì)胞,從而獲得比較純的腫瘤干細(xì)胞克隆球,便于腫瘤干細(xì)胞的進(jìn)一步研究.

有關(guān)結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞的特定標(biāo)志物仍存在爭議,目前大多數(shù)學(xué)者比較認(rèn)可的腫瘤標(biāo)記物有CD133、CD44、CD166,ALDH則被認(rèn)為很有可能成為腫瘤標(biāo)記物的分子,聯(lián)合多種標(biāo)記物進(jìn)行篩選可以更好地富集腫瘤干細(xì)胞.

本研究中通過無血清有限稀釋法從結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中篩選得到細(xì)胞克隆14個(gè),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞CD133+CD44+的陽性表達(dá)率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布,以及軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)等來鑒定篩選出的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞特點(diǎn).本次研究表明,篩得的細(xì)胞中能具有穩(wěn)定成球能力的占28.6%,這與陳克力等[16]運(yùn)用免疫磁珠分選法得出的91.2%有較大差距;而流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133+CD44+陽性表達(dá)率的結(jié)果則相似,本研究中測得HCT116中CD133+CD44+者高達(dá)87.97%,篩出的克隆球中CD133+CD44+者高達(dá)93.87%,陳克力等[16]測得免疫磁珠分選法得到的腫瘤干細(xì)胞群中CD133+CD44+占91.92%.另外,本實(shí)驗(yàn)中軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)均驗(yàn)證了本次實(shí)驗(yàn)篩得的細(xì)胞具有典型干性,即為腫瘤干細(xì)胞.

此外,槐耳清膏及氟尿嘧啶干預(yù)實(shí)驗(yàn)表明,腫瘤干細(xì)胞較原代細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性,這與已有的文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[17].槐耳清膏是藥用槐耳的熱水提取物,其主要抗癌成分為蛋白多糖,它因具有抗癌譜廣、抑瘤效果較明顯、藥效穩(wěn)定、無明顯毒性等特點(diǎn)而廣泛用于臨床.本研究中槐耳清膏對比氟尿嘧啶具有更強(qiáng)的抑制腫瘤生長作用,可得槐耳清膏對腫瘤干細(xì)胞的抑制作用可能更強(qiáng),更不易產(chǎn)生耐藥,甚至可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性.

本次研究表明,結(jié)腸癌細(xì)胞株中確實(shí)存在能夠自我更新和分化的腫瘤干細(xì)胞,雖然其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制仍在探索研究中,但腫瘤干細(xì)胞可能成為更有效治療腫瘤的突破口;而且中藥槐耳清膏對腫瘤干細(xì)胞的抑制作用為進(jìn)一步研究中醫(yī)藥抗腫瘤治療提供了參考.