劉拂曉，孫成友，李 嶺，王志亮

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109）

羊口瘡（orf）又稱傳染性膿皰（contagious ecthyma），由羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）感染引起[1]。該病最易感染羔山羊和羔綿羊，多呈群發(fā)性流行，成年羊?qū)ζ渫瑯右赘?，人亦可感染，因此屬于人獸共患病。患病羊主要表現(xiàn)為口唇處皮膚和黏膜形成丘疹、膿皰、潰瘍并結(jié)成疣狀厚痂。該病主要通過密切接觸傳播，病羊損傷的皮膚及黏膜是主要的傳播途徑，也可通過被病羊污染的廄舍或牧場傳播。本病通常采用弱毒苗免疫接種進(jìn)行預(yù)防：對3 月齡以上羊，采用下唇劃痕接種；對3 月齡以下羊，采用后股內(nèi)側(cè)劃痕接種。ORFV 屬痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒屬（Parapoxvirus）成員，為兩端共價閉合的線性雙股DNA 病毒，基因組全長約135 kb[2]。ORFV B2L 基因（開放閱讀框為1 137 bp）編碼一個高免疫原性的囊膜蛋白（B2L蛋白，379 aa，約42 kD）。該蛋白可在體內(nèi)誘導(dǎo)較高滴度的病毒中和抗體[3]，具有腫瘤治療及修飾免疫反應(yīng)的潛力[4]。

小 反 芻 獸 疫（peste des petits ruminants，PPR）是另一種羊常見傳染病，由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）感染引起。該病主要通過密切接觸傳播，以呼吸道和消化道為主要感染途徑，最易感染綿羊和山羊，羔羊更易感染發(fā)病，急性感染的死亡率可高達(dá)100%[5]。發(fā)病羊臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、厭食、高溫，口腔內(nèi)膜充血、潰瘍、糜爛，壞死組織脫落后形成不規(guī)則的糜爛斑，同時眼鼻伴有膿狀分泌物[6]。PPRV 或稱小反芻動物麻疹病毒（small ruminant morbillivirus，SRMV）[7]，屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）成員，可表達(dá)6 種結(jié)構(gòu)蛋白（N、P、M、F、H、L 蛋白）和2 種非結(jié)構(gòu)蛋白（V、C 蛋白）[8]。預(yù)防PPR 的主要方法是弱毒苗免疫。Nigeria75/1 疫苗株是目前應(yīng)用最為廣泛的PPRV 弱毒疫苗株，可在羊體內(nèi)誘導(dǎo)至少3 年的免疫保護期。另外，該疫苗株也是良好的病毒載體，通過反向遺傳技術(shù)拯救（或稱“復(fù)活”）的重組PPRV，可在體內(nèi)誘導(dǎo)良好的雙重免疫反應(yīng)[9-10]。

副黏病毒反向遺傳技術(shù)現(xiàn)已廣泛用于改造并拯救重組病毒。通常根據(jù)不同需求構(gòu)建全長cDNA clone，并構(gòu)建3 個輔助質(zhì)粒（N、P、L 蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒），然后將4 個質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞以拯救重組病毒。本課題組過去已成功構(gòu)建了PPRV 反向遺傳操作系統(tǒng)，并利用該系統(tǒng)拯救了兩株重組PPRV[11-12]。本研究首先構(gòu)建了含B2L 開放閱讀框的重組PPRV cDNA clone，然后利用已構(gòu)建的反向遺傳系統(tǒng)，成功拯救出表達(dá)B2L 蛋白的重組PPRV（rPPRV-B2L），從而為兩種疫病的二聯(lián)疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及質(zhì)粒

表達(dá)T7 RNA 聚合酶的BSR-T7/5 細(xì)胞，表達(dá)SLAM 受體的Vero-Dog-SLAM（VDS）細(xì)胞：本實驗室保存；無任何修飾的Nigeria 75/1 PPRV（Genbank 登錄號KY628761）拯救毒（rPPRV）：本實驗室構(gòu)建并保存；rSRMV-eGFP cDNA clone、pCAGGS-N、pCAGGS-P 及pCAGGS-L：本 實 驗室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

Not I 及Pme I：NEB 公 司 產(chǎn) 品；In-fusion同源重組試劑盒、PrimeScript ? One Step RTPCR Kit、PrimeSTAR Max Premix、無 蛋 白 封 閉液、HST16CR 感受態(tài)細(xì)胞：寶生物公司產(chǎn)品；PureLinkTM質(zhì)粒提取試劑盒、DMEM 培養(yǎng)基、G418、胎牛血清（FBS）、Lipofectine 2000轉(zhuǎn)染試劑、Pierce ECL 化學(xué)發(fā)光底物：Thermo Scientific 公司產(chǎn)品；High Pure Viral Nucleic Acid Kit：羅氏公司產(chǎn)品；anti-mouse IgG-peroxidase：Sigma 公司產(chǎn)品；B2L 蛋白單抗：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)于永忠老師惠贈。

1.3 rPPRV-B2L cDNA clone 構(gòu)建

對本課題組保存的rSRMV-eGFP cDNA clone[11]進(jìn)行改造，構(gòu)建含B2L 基因開放閱讀框 的 重 組PPRV cDNA clone（rPPRV-B2L cDNA clone）。操作如下：利用Not I/Pme I 雙酶切消化cDNA clone，回收載體片段；利用In-fusion 試劑盒，通過同源重組方法，將載體片段與B2L 基因（Genbank 登錄號KX951407）開放閱讀框（兩端添加同源重組臂）進(jìn)行同源重組；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HST16CR 感受態(tài)細(xì)胞，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；挑取典型菌落培養(yǎng)并進(jìn)行測序驗證；對序列正確的rPPRV-B2L cDNA clone，采 用PureLinkTM質(zhì) 粒 提取試劑盒，提取高純度的轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒。

1.4 rPPRV-B2L 拯救

將rPPRV-B2L cDNA clone 及3 個 輔 助 質(zhì) 粒（pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L） 共 轉(zhuǎn)染BSR-T7/5 細(xì)胞。操作如下：轉(zhuǎn)染前一天，取一6 孔板接種BSR-T7/5 細(xì)胞。次日，細(xì)胞匯合度為70%左右時，采用Lipofectine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，將4個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至BSR-T7/5 細(xì)胞。rPPRV-B2L cDNA clone、pCAGGS-N、pCAGGS-P 和pCAGGS-L 轉(zhuǎn)染量分別為2.5、1.5、1.0、1.0 μg/孔。吸棄轉(zhuǎn)染6 h 后的培養(yǎng)基，補加10% FBS 的DMEM，將細(xì)胞置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 rPPRV-B2L 盲傳

rPPRV-B2L 盲傳前一天，將VDS 細(xì)胞接種T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待次日盲傳，細(xì)胞匯合度應(yīng)為50%～70%。細(xì)胞共轉(zhuǎn)染5～7 d后，將6孔板凍融1次，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000 r/min 離心5 min，收獲上清。吸棄T25 培養(yǎng)瓶中VDS 細(xì)胞培養(yǎng)液，補加離心收獲的上清。將培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置3～5 h，使重組病毒充分感染VDS 細(xì)胞。吸棄舊培養(yǎng)液，補加DMEM 培養(yǎng)基（含5% FBS、G418）繼續(xù)培養(yǎng)。若盲傳第1 代無明顯細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），則進(jìn)一步盲傳，直至出現(xiàn)典型CPE，即合胞體形成。待CPE 出現(xiàn)后，繼續(xù)對重組病毒進(jìn)行盲傳，直至第7 代。

1.6 rPPRV-B2L 鑒定

收獲第7 代病毒培養(yǎng)液，通過High Pure Viral Nucleic Acid Kit 抽提病毒核酸，采用PrimeScript ?One Step RT-PCR Kit 進(jìn)行RT-PCR 鑒定。上游引物P-f：5'-AGCCATTCTTGCCAAGCAGCCGTAA-3'；下游引物P-r：5'-TATCAAAATCGTAGATCTCGGTCAT-3'。上下游引物退火位點如圖1 所示。RTPCR 反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)。為避免殘留的cDNA clone 質(zhì)粒對結(jié)果造成干擾，同時采用PrimeSTAR Max Premix 進(jìn)行PCR 擴增作為對照，反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s，共30 個循環(huán)。RT-PCR 和PCR 產(chǎn)物同時進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳陽性條帶切膠后送青島志遠(yuǎn)公司測序。

圖1 rPPRV-B2L 拯救的四質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)

1.7 rPPRV-B2L 生長曲線

將第7 代rPPRV-B2L 和第7 代rPPRV 同時進(jìn)行生長曲線測定，然后比較二者的差異。將VDS 細(xì)胞接種于T25 培養(yǎng)瓶（4×106細(xì)胞/瓶），置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h 后，將病毒接種VDS 細(xì)胞（MOI =0.01），繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別于0、24、48、72、96 h 收集100 μL 上清液，立即進(jìn)行TCID50分析，采用Spearman-K?rber 方法[13]進(jìn)行病毒滴度測定，并將所測得結(jié)果繪制生長曲線。

1.8 B2L 蛋白Western blot 分析

將rPPRV-B2L 接種VDS 細(xì)胞（MOI=0.01），置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；收獲細(xì)胞沉淀，用PBS 重懸后與loading buffer 混合，95 ℃孵育10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。將電泳后的凝膠進(jìn)行半干轉(zhuǎn)印，將轉(zhuǎn)印后的膜依次進(jìn)行TBST 漂洗3 次（10 min/次），無蛋白封閉液封閉1 h，一抗（B2L 蛋白單抗）封閉2 h，漂洗3 次（10 min/次），二抗（anti-mouse IgG-peroxidase）封閉1 h，漂洗3 次（10 min/次），Pierce ECL 化學(xué)發(fā)光底物處理、拍照。

1.9 B2L 蛋白質(zhì)譜分析

為證實B2L 蛋白的表達(dá)，將B2L 蛋白在SDS-PAGE凝膠中對應(yīng)的條帶切下，送華大基因（北京）進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 rPPRV-B2L cDNA clone 構(gòu)建

利用In-fusion 試劑盒，通過同源重組方法構(gòu)建的rPPRV-B2L cDNA clone 質(zhì)粒，經(jīng)測序證實核酸序列完全正確，其結(jié)構(gòu)圖如圖1 所示。由于BSR-T7/5 細(xì)胞可以表達(dá)T7 RNA 聚合酶[14]，因此T7P 可以啟動cDNA clone 轉(zhuǎn)錄；T7T 為T7 終止子（terminator），負(fù)責(zé)終止T7 轉(zhuǎn)錄[15]；HDV 作為核酶可剪切出精確的cDNA clone RNA 3'末端結(jié)構(gòu)[16]。為增強B2L 蛋白的表達(dá)，在其開放閱讀框上游添加Kozak 序列[17]。

2.2 rPPRV-B2L 拯救及盲傳

將rPPRV-B2L cDNA clone、pCAGGS-N、pCAGGS-P、pCAGGS-L 4 個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，以拯救重組病毒。BSR-T7/5 細(xì)胞在拯救過程中提供T7 RNA 聚合酶，但無CPE 產(chǎn)生。將病毒在VDS 細(xì)胞中連續(xù)盲傳，第2 次傳代72 h 后，便可觀察到明顯CPE，即合胞體形成（圖2-B），而同期非感染細(xì)胞對照則無此現(xiàn)象（圖2-D）。

圖2 rPPRV-B2L 盲傳第2 代72 h 導(dǎo)致的VDS 細(xì)胞病變

2.3 rPPRV-B2L 鑒定

對第7 代盲傳病毒提取總核酸后進(jìn)行RT-PCR分析，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3 所示。P-f/P-r引物對成功擴增了1 411 bp 目的片段，而PCR 對照則未出現(xiàn)擴增條帶。將該目的條帶切下測序，結(jié)果與目的核酸序列一致，說明已成功拯救了PPRV-B2L。

圖3 第7 代rPPRV-B2L RT-PCR 分析結(jié)果

2.4 rPPRV-B2L 生長曲線

分 別 取0、24、48、72、96 h rPPRV-B2L 和rPPRV 感染的細(xì)胞上清，測定TCID50值，將所測結(jié)果繪制病毒生長曲線。生長曲線（圖4）顯示，在0～96 h 病毒感染細(xì)胞的培養(yǎng)周期內(nèi)，rPPRVB2L 的復(fù)制速率稍低于rPPRV，但在感染96 h 時二者幾乎達(dá)到同一生長滴度，約107TCID50/mL，說明外源基因的插入并未顯著影響病毒的生長動力學(xué)特性。

圖4 第7 代rPPRV-B2L 及同代次rPPRV 生長曲線

2.5 B2L 蛋白Western blot 分析

將rPPRV-B2L 感染72 h 后的細(xì)胞進(jìn)行Western blot 分析，結(jié)果如圖5 所示：在42 kD 處，兩條rPPRV-B2L 泳道出現(xiàn)典型的B2L 蛋白印記帶，而同一位置兩條rPPRV 泳道未見類似條帶，說明B2L 蛋白在胞內(nèi)成功表達(dá)。

圖5 B2L 蛋白表達(dá)的Western blot 分析結(jié)果

2.6 B2L 蛋白質(zhì)譜分析

為證實B2L 蛋白的表達(dá)，切下SDS-PAGE凝膠中B2L 蛋白對應(yīng)條帶，送華大基因（北京）進(jìn)行質(zhì)譜分析。圖6-A 為B2L 蛋白完整氨基酸序列，共379 aa，紅色字體標(biāo)注的氨基酸序列為質(zhì)譜分析匹配肽段，占整個氨基酸序列的63%。5 個典型的質(zhì)譜分析匹配肽段如圖6-B 所示。質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)一步證實了B2L 蛋白在胞內(nèi)正確表達(dá)。

圖6 B2L 蛋白表達(dá)的質(zhì)譜分析結(jié)果

3 討論

相對于麻疹病毒屬其他成員反向遺傳平臺的構(gòu)建[18-20]，PPRV 的研究報道相對較晚。Hu 等[21]于2012 年首次報道了表達(dá)綠色熒光蛋白的重組PPRV。由于PPRV 基因組cDNA clone 在構(gòu)建過程中不穩(wěn)定，較易發(fā)生突變或片段序列丟失現(xiàn)象，因此構(gòu)建全長感染性克隆是制約病毒拯救的最大因素。解決該問題通常有兩種方法：一是采用低拷貝數(shù)質(zhì)粒構(gòu)建cDNA clone（本研究采用了pBR322質(zhì)粒作為骨架）；二是采用對質(zhì)粒復(fù)制保真性更高的感受態(tài)細(xì)胞（本研究采用了HST16CR 細(xì)胞）。通過這兩種方法構(gòu)建cDNA clone，通?？山鉀Q突變或基因缺失問題。

在全長cDNA clone 中，外源基因的插入位點有多種選擇，然而很難通過比較，篩選最佳的插入位點。按照以往的報道，P 和M 基因之間區(qū)域是最廣泛使用的外源基因插入位點[22-26]，本研究亦如此。目前重組副黏病毒cDNA clone 的啟動子通常有兩種選擇——T7 和CMV 啟動子。本研究采用的是T7 啟動子，需要有T7 RNA 聚合酶的作用才可啟動轉(zhuǎn)錄。因此，本研究在拯救過程中采用的是表達(dá)該酶的細(xì)胞系（BSR-T7/5）。然而該細(xì)胞系不是PPRV 感染的敏感細(xì)胞，因此僅僅用作病毒拯救而不是傳代。

病毒盲傳過程中，通常第2 代或第3 代便可于顯微鏡下觀察到明顯的CPE。PPRV 的典型CPE表現(xiàn)為合胞體形成，因此若在盲傳過程中觀察到此現(xiàn)象，便可初步證明病毒拯救成功。接下來通過多次傳代，收集病毒液提取總核酸，用于RT-PCR 分析，以證明病毒拯救是否成功。按照經(jīng)驗，通常盲傳5 代之后，cDNA clone 質(zhì)粒干擾便可消除，但在RT-PCR 鑒定過程中依然需設(shè)PCR 對照。本研究中，第7 代病毒的RT-PCR 檢測呈陽性，PCR 對照為陰性，由此證明了重組病毒拯救成功。

外源基因的引入通常會在某種程度上影響病毒的復(fù)制效率，因此本研究比較了第7 代rPPRVB2L 和第7 代rPPRV 的生長動力曲線。為使比較結(jié)果更為準(zhǔn)確，本研究未將rPPRV-B2L 與Nigeria疫苗毒株進(jìn)行比較，而是與同代次Nigeria 疫苗株的拯救毒株進(jìn)行比較。隨著傳代次數(shù)的增加，病毒將越來越適應(yīng)細(xì)胞[27]，換言之，其在胞內(nèi)的復(fù)制效率也將逐步升高，因此確保選擇同代次的兩種病毒，是比較二者復(fù)制動力學(xué)的前提。

本研究的目的是構(gòu)建表達(dá)B2L 蛋白的重組PPRV，因此需對B2L 蛋白的表達(dá)進(jìn)行驗證。首先以B2L 蛋白單抗作為一抗進(jìn)行Western blot 驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rPPRV-B2L 泳道出現(xiàn)B2L 蛋白印記帶，而rPPRV 對照則沒有，說明rPPRV-B2L 可有效表達(dá)B2L 蛋白。為驗證B2L 蛋白的表達(dá)，本研究曾以B2L 蛋白單抗作為一抗，對rPPRV-B2L 感染的VDS 細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光分析，然而熒光顯微鏡下并未出現(xiàn)預(yù)期的熒光現(xiàn)象。這可能與B2L 蛋白單抗有關(guān)，因為識別線性表位的單抗有時不應(yīng)用于細(xì)胞的免疫熒光分析，換言之，單抗識別的線性表位可能會被胞內(nèi)目的蛋白復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)所掩蓋。因此，為進(jìn)一步證實蛋白的表達(dá)，本研究又進(jìn)行了蛋白質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜結(jié)果與B2L 蛋白全長氨基酸序列的匹配度達(dá)到63%，這進(jìn)一步證實了B2L 蛋白的表達(dá)。

羊口瘡和小反芻獸疫是山羊和綿羊常見的兩種病毒性傳染病，二者甚至在同一地區(qū)同時流行。目前防控兩種疫病的有效疫苗皆為弱毒疫苗，但臨床未見二聯(lián)疫苗使用的報道。本研究通過反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)B2L 蛋白的重組PPRV，為羊口瘡和小反芻獸疫二聯(lián)疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。

致謝：

特別感謝黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)于永忠老師對于B2L 蛋白單抗的惠贈。