史明偉，祝有為，言燕華，韋武青，徐迎春*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.鎮(zhèn)江市潤州區(qū)林業(yè)果茶指導(dǎo)站，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；3.鎮(zhèn)江市蔬菜研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212021)

油用牡丹是指種子可加工牡丹籽油的一類牡丹品種。其中鳳丹(Paeoniaostii)由于結(jié)實(shí)率高，種子產(chǎn)量大，生長適應(yīng)性強(qiáng)，作為主要栽培的油用牡丹品種在全國大面積推廣。鳳丹是由楊山牡丹長期栽培演化形成的觀賞兼藥用的品種群[1]，與觀賞用的牡丹(P.suffruticosa)并列為植物學(xué)上的種，為江南牡丹品種群的一個(gè)亞群[2-3]。鳳丹屬于異花授粉植物，雖有一定的自交親和性，但自交親和性很差[4]，需要進(jìn)行異花異株授粉。長期以來一直用種子繁殖苗木，形成了豐富的自然變異類群。

鳳丹的果實(shí)為蓇葖果，由多個(gè)小果組成，具有多個(gè)心皮。一般認(rèn)為鳳丹具3～8枚小果[5]，多數(shù)品種為5枚。但據(jù)沈保安等[6]研究，安徽銅陵鳳凰山和安徽南陵丫山產(chǎn)的鳳丹有一個(gè)類群的蓇葖果通常6～8枚，將其定名為多果牡丹PaeoniaostiiT.Hong et J.X.Zhang ssp.lishizhenenii(B.A.Shen)。作者在安徽銅陵的鳳丹田里發(fā)現(xiàn)了若干具有6～8枚蓇葖果特征的鳳丹單株，與沈保安所述的多果牡丹在形態(tài)上相似。關(guān)于多果牡丹目前只有植物學(xué)外觀形態(tài)特征方面的證據(jù)[6]，尚缺乏更科學(xué)、更精確的證據(jù)以證實(shí)其多果特性是一種特異的遺傳性狀。鳳丹果實(shí)的蓇葖果由離生心皮雌蕊發(fā)育而來，心皮數(shù)量決定了最終蓇葖果的數(shù)量，鳳丹多果性狀的產(chǎn)生可能受與心皮發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控，目前為止尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于鳳丹果莢果數(shù)的研究報(bào)道。

為研究該變異的類型和產(chǎn)生的原因，本試驗(yàn)選取上一年所結(jié)果實(shí)分別為5果、6果、7果、8果的鳳丹進(jìn)行人工異花授粉，試圖探究鳳丹的多果性狀是否可以穩(wěn)定表達(dá)；并且從相關(guān)研究文獻(xiàn)中找到與心皮發(fā)育相關(guān)的基因[7-9]，在鳳丹轉(zhuǎn)錄組中找到同源基因，選取多果鳳丹花芽為材料，檢測鳳丹中與心皮發(fā)育相關(guān)的基因在不同果數(shù)鳳丹花芽中的相對表達(dá)量，試圖找出可能與鳳丹多果性狀產(chǎn)生相關(guān)的基因。同時(shí)，通過觀察多果鳳丹的生物學(xué)特性，以找出多果鳳丹與普通鳳丹的異同，從而研究鳳丹果實(shí)果數(shù)與產(chǎn)量之間的關(guān)系，為進(jìn)一步探究鳳丹多果性狀產(chǎn)生的原因及培育高產(chǎn)的鳳丹新品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2014年6月，在安徽銅陵鳳凰山鳳丹生產(chǎn)基地6年生鳳丹植株中，選取了40個(gè)具有多果性狀的鳳丹單株，分別標(biāo)記。單株全部果實(shí)小果數(shù)均為6、7、8個(gè)的植株分別標(biāo)記為6、7、8果鳳丹(圖1)，以5果普通鳳丹作為對照。

圖1 不同果數(shù)鳳丹的果實(shí)

1.2 多果鳳丹植株的生長特性觀測

2015年2月15日至5月15日，在鳳丹結(jié)果期之前，分別觀察記錄不同生長時(shí)期5果、6果、7果、8果鳳丹的生物學(xué)特征及物候期。觀測內(nèi)容為：萌芽期的芽數(shù)、芽長與芽寬(每株觀測3個(gè)芽)，盛花期單株著花數(shù)、花直徑、花期。每組觀察10株。

5月至8月，從結(jié)果期至果實(shí)采收期對鳳丹結(jié)果期的生物學(xué)特征進(jìn)行觀察記錄，具體內(nèi)容為：株高、冠幅、結(jié)果枝葉片數(shù)、結(jié)果母枝長度與粗度(每株觀測3個(gè)母枝)。每組觀測10株。

8月初至9月初，采收成熟的蓇葖果，測量蓇葖果的鮮重、小果的長度、厚度及種子的千粒重，統(tǒng)計(jì)單果種子數(shù)。

1.3 多果鳳丹植株后代性狀分離情況

2016年4月，按果數(shù)不同分別編號A(5果鳳丹)、B(6果鳳丹)、C(7果鳳丹)、D(8果鳳丹)，每種果數(shù)的鳳丹選取5株進(jìn)行試驗(yàn)，每株選擇3朵花作為母本，每個(gè)母本所授的花粉采自相同果數(shù)的其它鳳丹單株，分別標(biāo)記授粉。授粉后，觀察并記錄每朵花上的心皮數(shù)量；8月初統(tǒng)計(jì)每組自交授粉后的果數(shù)，計(jì)算不同蓇葖果數(shù)量的果實(shí)占總果實(shí)數(shù)量的比例。

1.4 心皮發(fā)育相關(guān)基因在多果鳳丹中相對表達(dá)量的測定

在鳳丹轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選了鳳丹中與心皮發(fā)育相關(guān)的6個(gè)基因，分別為AGAMOUS-1(AG-1)、AGAMOUS-2(AG-2)、AGAMOUS-like8-1(AGL8-1)、AGAMOUS-like8-2(AGL8-2)、AGAMOUS-like62(AGL62)、SPATULA(SPT)。并以前人的研究為基礎(chǔ)，選取了看家基因ubiquitin作為內(nèi)參基因[10]。根據(jù)定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0和Beacon designer 7軟件同時(shí)設(shè)計(jì)6個(gè)目的基因的引物，并在NCBI Primer-Blast上對引物的特異性進(jìn)行檢測，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物具體序列見表1。

表1 Real-time PCR檢測中所用基因的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2007和SPSS軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多果鳳丹的生物學(xué)特性

2.1.1 多果鳳丹株高、冠幅、結(jié)果枝的特性 從株高和冠幅的測量結(jié)果(表2)可以看出多果鳳丹和普通5果鳳丹在株高和冠幅方面沒有顯著區(qū)別。觀察結(jié)果(表3)顯示多果鳳丹和普通5果鳳丹之間結(jié)果枝長度、結(jié)果枝粗度、結(jié)果枝上的復(fù)葉數(shù)、結(jié)果母枝長度以及母枝粗度均沒有顯著區(qū)別，結(jié)果枝長度在45～50 cm，粗度在10～13 mm，復(fù)葉數(shù)在11～12片；結(jié)果母枝長度在14～17 cm，粗度在16～17 mm。多果鳳丹果實(shí)結(jié)果枝的長度、粗度可以反映多果鳳丹所在枝條的營養(yǎng)貯藏狀況，可見不同果數(shù)鳳丹枝條貯藏的營養(yǎng)并無顯著區(qū)別。

表2 不同果數(shù)鳳丹的株高、冠幅

表3 不同果數(shù)鳳丹結(jié)果枝的生長特性

2.1.2 多果鳳丹芽的特性 觀察多果鳳丹在萌芽期芽的部分特性(表4)，結(jié)果顯示不同果數(shù)的鳳丹在芽數(shù)量和芽長度上無明顯區(qū)別，芽數(shù)均在17～20個(gè)，芽長在4.2～4.6 cm。但多果鳳丹的芽寬均大于5果鳳丹，其中以8果鳳丹的芽寬最大，7果鳳丹次之，6果鳳丹的芽寬稍高于對照，而從芽的長寬比也可以看出這種差別。

表4 不同果數(shù)鳳丹芽的特性

2.1.3 多果鳳丹的開花特性 從4月中旬開始，分別觀測多果鳳丹盛花期的著花數(shù)、花直徑以及開花持續(xù)時(shí)間(表5)。結(jié)果顯示：不同果數(shù)鳳丹之間在著花數(shù)和花期方面沒有顯著區(qū)別，由于引種時(shí)間短，每株鳳丹上的著花數(shù)都不多，平均在3個(gè)左右，少數(shù)出現(xiàn)5～7朵花，花期持續(xù)時(shí)間均在13～14 d。但從花朵直徑來看，多果鳳丹尤其是7果、8果鳳丹的花朵直徑要大于5果鳳丹和6果鳳丹。

表5 不同果數(shù)鳳丹的開花特性

2.1.4 多果鳳丹人工異花授粉后性狀分離情況 通過對結(jié)實(shí)后果實(shí)心皮(表6)的觀察發(fā)現(xiàn)，多果鳳丹的果數(shù)與前一年相比發(fā)生了較大變化。在單株鳳丹上結(jié)的果實(shí)出現(xiàn)不同果數(shù)的現(xiàn)象，原5果鳳丹果實(shí)果數(shù)變化不大，授粉后15朵花有1朵結(jié)出的果實(shí)枯萎，沒有結(jié)籽，其余14朵仍為5果果實(shí)，占5果鳳丹所結(jié)果實(shí)數(shù)量的100%；而原6果鳳丹中出現(xiàn)了47%五果的果實(shí)和53% 6果的果實(shí)；原7果鳳丹所結(jié)果實(shí)中五果果實(shí)占33%，六果果實(shí)占20%，7果果實(shí)數(shù)量最多，占47%；原8果鳳丹中15朵花也全部結(jié)實(shí)，5果、6果、7果、8果的果實(shí)都有，在所結(jié)果實(shí)總量的比例分別為27%、20%、27%、26%。

另外，在授粉后，聚合心皮剛剛分離時(shí)對心皮數(shù)量的觀察發(fā)現(xiàn)，有少數(shù)授粉后的花心皮數(shù)量超過8個(gè)，最多的達(dá)到10個(gè)心皮，但絕大多數(shù)花的心皮數(shù)仍為5～8個(gè)(圖2)。后續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，多心皮的花多數(shù)心皮在發(fā)育過程中會(huì)逐漸萎蔫、脫落，最終會(huì)留下5～8個(gè)心皮發(fā)育成熟。

A：心皮數(shù)為5；B：心皮數(shù)為7；C：心皮數(shù)為10。

2.1.5 多果鳳丹成熟果實(shí)和種子品質(zhì)的情況 考察多果鳳丹果實(shí)和種子的品質(zhì)特征，可以看出(表7)，不同果數(shù)鳳丹新采單個(gè)果實(shí)的大小(直徑和厚度)基本沒有變化，但果實(shí)的鮮重隨著蓇葖果數(shù)量的增加而增大。單果結(jié)籽數(shù)同樣隨著單個(gè)果實(shí)蓇葖果數(shù)量的增加而增多，說明果莢數(shù)量的增多會(huì)帶來單果結(jié)籽量的增大。而從作為種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一的千粒重來看，6果、7果鳳丹的種子較5果鳳丹種子更加飽滿，但8果鳳丹雖然單果結(jié)籽量最大，但千粒重最小。

2.2 心皮發(fā)育相關(guān)基因在多果鳳丹中的表達(dá)特征

本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量的方法測定了鳳丹中6個(gè)與心皮發(fā)育相關(guān)的基因分別在5果、6果、7果、8果鳳丹中的相對表達(dá)量。從圖3可以看出，各目的基因在不同果數(shù)鳳丹中的表達(dá)情況也各不相同。AG-1和AG-2在普通5果鳳丹中的相對表達(dá)量最高，而它們在6果、7果和8果鳳丹中相對表達(dá)量差別不大，卻都明顯低于在普通5果鳳丹中的相對表達(dá)量。AGL8-1和AGL62同樣在普通5果鳳丹中表達(dá)量最高，而隨著果數(shù)增加，這兩個(gè)基因的相對表達(dá)量呈逐漸減少的趨勢，且在8果鳳丹中的相對表達(dá)量都顯著低于5果鳳丹。AGL8-2在不同果數(shù)鳳丹中的表達(dá)情況相似，沒有明顯差別，但在8果鳳丹中同樣表達(dá)略少。SPT則在8果鳳丹中相對表達(dá)量最高，而在6果和7果鳳丹中相對表達(dá)量又很低，沒有呈現(xiàn)出任何規(guī)律。

表6 授粉后成熟蓇葖果數(shù)量的變化 %

表7 成熟果實(shí)和種子的品質(zhì)指標(biāo)

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析鳳丹心皮發(fā)育相關(guān)基因的相對表達(dá)量

3 討論

3.1 多果鳳丹的生物學(xué)特征

本研究所觀測的多果鳳丹，其萌芽期、開花期及結(jié)果期等基本物候期與普通5果鳳丹基本一致，沒有顯著差異，均在2月中下旬開始萌芽，4月初陸續(xù)開花，果實(shí)成熟時(shí)間一般為8月中上旬。除此之外，多果鳳丹的株高、冠幅、萌芽數(shù)、著花數(shù)、結(jié)果枝特性、果實(shí)的直徑與厚度都與5果鳳丹相似，但多果鳳丹較5果鳳丹的芽、花直徑更大，芽長寬比更小。沈保安[6]在安徽發(fā)現(xiàn)的多果牡丹花的直徑可達(dá)到14～20 cm，而本研究觀測的多果鳳丹花的直徑多在9～10 cm，與沈保安發(fā)現(xiàn)的多果牡丹有一定的差異，主要原因是本研究觀測的是6年生鳳丹。此外，除了具8個(gè)蓇葖果的鳳丹外，其余多果鳳丹的千粒重均顯著大于正常鳳丹果實(shí)，這是因?yàn)榫?個(gè)蓇葖果的果實(shí)所結(jié)種子的數(shù)量過多時(shí)，種子生長空間受限，營養(yǎng)不足，會(huì)使得許多種子干癟，籽粒不夠飽滿，種子體積小，進(jìn)而導(dǎo)致千粒重顯著下降。

3.2 心皮發(fā)育相關(guān)基因在不同果數(shù)鳳丹中的表達(dá)特征

本研究發(fā)現(xiàn)，在人工異花授粉后，有些果實(shí)開始心皮數(shù)較多，隨著果實(shí)的成熟，有些果實(shí)便會(huì)逐漸干癟、脫落，最終得到的蓇葖果數(shù)量仍在5～8個(gè)，初步推測鳳丹多果性狀可能是由基因控制的可遺傳的性狀。擬南芥心皮發(fā)育主要受CRABSCLAW及SPT基因的控制，兩者都屬于MADSbox基因家族成員[11]。趙燕等[11]選取擬南芥和薺菜為材料，將擬南芥CRABSCLAW基因和克隆的薺菜CRABSCLAW同源基因cDNA交互轉(zhuǎn)化后，兩者的心皮形態(tài)和大小都發(fā)生了變化，可見心皮發(fā)育受基因調(diào)控顯著。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AG-1和AG-2在普通5果鳳丹中的相對表達(dá)量顯著高于其在其他多果鳳丹中的相對表達(dá)量，可以推測這兩個(gè)基因的表達(dá)有可能會(huì)抑制多果的形成。在鳳丹果莢形成過程中，我們觀察到鳳丹授粉后，心皮剛剛分離時(shí)，心皮數(shù)量可能會(huì)多達(dá)10個(gè)，但最終多出的心皮會(huì)在發(fā)育過程中萎縮死亡，最終留下5個(gè)心皮發(fā)育成熟。如果該死亡過程是基因?qū)е碌某绦蛐运劳?，那么根?jù)多果鳳丹中AG-1和AG-2兩個(gè)基因的表達(dá)量顯著減少，推測AG-1和AG-2基因有可能參與調(diào)控多余心皮的程序性死亡。AGL8-1和AGL62的相對表達(dá)量會(huì)隨著果數(shù)增加呈逐漸減少的趨勢，且在8果鳳丹中的相對表達(dá)量都顯著低于5果鳳丹。由此推測，AGL8-1和AGL62基因也可能參與了鳳丹果莢果數(shù)最終形成的過程，這兩個(gè)基因的表達(dá)量可能與最終鳳丹果莢成熟時(shí)心皮的數(shù)量有關(guān)。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果來看，多果鳳丹比普通鳳丹芽直徑、花朵大，千粒重大，其他生物學(xué)特性基本一致。鳳丹多果性狀可能是由控制心皮發(fā)育的相關(guān)基因AG-1、AG-2、AGL8-1和AGL62調(diào)控的，后續(xù)還需進(jìn)行嫁接試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證多果性狀是否為可遺傳的特異性狀；7果鳳丹結(jié)籽量大，種子飽滿，果實(shí)重量適中，符合高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的育種要求，可以作為優(yōu)良品種進(jìn)行選育。