1.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所,貴州 貴陽 550004；2.貴陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，貴州 貴陽 550004

維E三油膠丸是貴州神奇藥業(yè)有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的品種，曾用名為心腦三效膠丸，處方由維生素E、精魚油、月見草油和蘇子油組成，主要用于高脂血癥。維E三油膠丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對處方中的維生素E進(jìn)行了質(zhì)量控制，而未對處方中其他三種成分進(jìn)行質(zhì)量控制。為確保藥品質(zhì)量，保障用藥安全，研究對處方中的精魚油、月見草油和蘇子油均進(jìn)行了相應(yīng)的質(zhì)量控制。蘇子油的主要有效成分為α-亞麻酸，具有降脂、降壓、降糖、抑制出血性腦疾病和血栓性疾病、增強(qiáng)智力、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)視力、預(yù)防過敏性疾病、預(yù)防炎癥以及減緩人體衰老等功能[1-5]。月見草油的主要有效成分為γ-亞麻酸，具有抗炎、抗脂質(zhì)氧化、抗血栓、降脂、降糖等作用,已應(yīng)用于多種臨床疾病[6-10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津GC-2014氣相色譜儀(FID檢測器)；島津GC-2010plus氣相色譜儀(FID檢測器)；METTLER TOLEDO XS205電子天平；METTLER TOLEDO XPE206DR電子天平；PEG-20M(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱；DB-WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱；PEG-20M(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱。

1.2 試劑與試藥 α-亞麻酸甲酯對照品(批號：111624-201705)、γ-亞麻酸甲酯對照品(批號：110898-201605)均購自中國食品藥品檢定研究院，二十一烷酸甲酯(批號：M2260010，ANPLE Laboratory Technologies(shanghai)Inc)；正二十四烷(批號：122365，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；十七烷酸甲酯(批號：T2370005，ANPLE Laboratory Technologies(shanghai)Inc)；正十九烷(批號：115410，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；其余試劑為分析純，市售；維E三油膠丸(批號：S20171001、S20171002、S20171003、S20171004、S20171005、S20171006、S20171007、S20171008、S20171009、S20171010)均由貴州神奇制藥有限公司提供。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品批號為S20171010。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及測定法

2.1.1 色譜條件 采用DB-WΑX(30m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱；柱溫210℃；FID檢測器；進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度為250℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比為10∶1。二十一烷酸甲酯峰、α-亞麻酸甲酯峰和γ-亞麻酸甲酯峰分別與相鄰峰之間的分離度均應(yīng)符合要求。

2.1.2 測定法 精密稱取二十一烷酸甲酯適量，加正庚烷配制成每1 mL約含2.5 mg 的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液；精密稱取α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯對照品適量，加正庚烷配制成每1 mL約含α-亞麻酸甲酯15 mg 和γ-亞麻酸甲酯2.5 mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液(1)，精密量取對照品溶液(1)和內(nèi)標(biāo)溶液各2 mL置10 mL量瓶中，加正庚烷定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液；取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置具塞試管中，加入0.5 mol·L-1氫氧化鉀甲醇溶液2 mL，密塞，置60℃水浴中皂化15 min，待油珠完全溶解，放冷，加15%三氟化硼甲醇溶液2 mL，振搖，密塞，置60℃水浴中酯化2 min，放冷，精密加入正庚烷8 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，振搖，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，振搖，靜置，取上層液作為供試品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各1∶l，分別注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算供試品中α-亞麻酸和γ-亞麻酸的含量，結(jié)果乘以0.952，即得。

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取二十一烷酸甲酯0.256 4 g置100 mL量瓶中，加正庚烷溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取α-亞麻酸甲酯對照品0.308 0 g和γ-亞麻酸甲酯對照品0.049 76 g置同一20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗(yàn) 采用廠家提供的缺月見草油陰性樣品和缺蘇子油陰性樣品，按“2.1”條項(xiàng)下色譜條件及樣品測定法進(jìn)行檢測，結(jié)果陰性樣品均無干擾。供試品中α-亞麻酸甲酯峰、γ-亞麻酸甲酯峰和二十一烷酸甲酯峰的保留時(shí)間，與對照溶液中的保留時(shí)間一致，各測定峰峰型良好，與相鄰峰分離度達(dá)到要求。

2.4 線性考察 精密量取對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0和5 mL分別置10 mL量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，加正庚烷定容至刻度，作為線性1到6溶液。分別吸取上述線性1到6溶液各 1(l注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖。以α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯對照品的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得α-亞麻酸甲酯回歸方程：Y=1.837 6X-0.000 6(r=1.000)，表明α-亞麻酸甲酯在0.308 0～7.699 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；γ-亞麻酸甲酯回歸方程：Y=1.824 8X+0.001 7(r=1.000)，表明γ-亞麻酸甲酯在0.049 71～1.243 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1”條項(xiàng)下制備供試品溶液和對照品溶液，室溫下分別在0、2、4、6、8和12 h精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1(l注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖。結(jié)果對照品溶液和供試品溶液中α-亞麻酸甲酯與內(nèi)標(biāo)比值RSD分別為0.65%和0.90%，γ-亞麻酸甲酯與內(nèi)標(biāo)比值RSD分別為0.34%和0.28%。表明對照品溶液和供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1”條項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，同時(shí)制備對照品溶液，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1∶l注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果α-亞麻酸含量為140.933 6 mg/g，RSD為0.68%；γ-亞麻酸含量為23.571 7 mg/g，RSD為0.73%。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取γ-亞麻酸甲酯對照品0.050 11 g，置20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液(1)；精密稱取α-亞麻酸甲酯對照品0.290 7 g，置20 mL量瓶中，加正庚烷溶解定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液(2)。精密稱取二十一烷酸甲酯0.063 00 g置25 mL量瓶中，加正庚烷溶解稀釋至刻度，搖勻，即得內(nèi)標(biāo)溶液。精密稱取樣品約0.08 g、0.10 g和0.12 g，置50 mL具塞試管中，按“2.1”條下測定法同法操作至置60℃水浴中酯化2 min，放冷，各精密加入對照品貯備液(1)和對照品貯備液(2)0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL，再分別精密加入正庚烷6.4 mL、6.0 mL和5.6 mL，振搖，加飽和氯化鈉溶液2 mL，振搖，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 mL，振搖，靜置，取上層液，即得。高、中、低3個(gè)濃度樣品，各平行制備3份，共9份。結(jié)果α -亞麻酸回收率為99.44%(n=9，RSD=1.9%)，γ-亞麻酸回收率為99.14%(n=9，RSD=2.0%)。

2.8 耐用性試驗(yàn) 按“2.1”條項(xiàng)下測定法制備供試品溶液和對照品溶液，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1 μL注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量。比較了不同色譜柱、不同進(jìn)樣口溫度、不同檢測器溫度、不同柱溫和不同儀器對測定結(jié)果的影響，各條件下，各色譜峰峰型良好，與相鄰峰分離度均達(dá)到要求。結(jié)果表明該方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果良好。

2.9 檢出限和定量限的測定 按 “2.1”項(xiàng)下制備對照品溶液，并稀釋制成不同濃度的對照品溶液，精密量取各1∶1注入氣相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)條項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，以信噪比S/N≈10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限、S/N≈3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測限。測得α-亞麻酸和γ-亞麻酸的檢出限約為29.3 ng和23.66 ng；測得α-亞麻酸和γ-亞麻酸的定量限約為146.6 ng和70.99 ng。

2.10 樣品含量測定 按“2.1”條項(xiàng)下測定法制備10批次樣品的供試品溶液，同時(shí)制備對照品溶液，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1∶1注入氣相色譜儀中，按“2.1”條項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果如下。

表1 10批次樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 樣品制備過程的優(yōu)選 經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，要測定樣品中α-亞麻酸和γ-亞麻酸的含量，需要對樣品進(jìn)行甲酯化后進(jìn)行測定。目前甲酯化的方法主要有三氟化硼-甲醇法、酸催化法、快速甲酯化法等[6-7]。通過前期的大量實(shí)驗(yàn)，選擇三氟化硼-甲醇法，該法由于其先用堿中和了非中性的游離脂肪酸，又用三氟化硼作酸性催化劑，在一定的溫度下，加速了甲醇和油脂之間進(jìn)行的醇解反應(yīng)，使油脂的甲酯化既快又完全試驗(yàn)中加入飽和氯化鈉可加大溶液中離子的強(qiáng)度，有利于脂肪酸甲酯被充分提取出[11-12]。影響提取α-亞麻酸甲酯和γ-亞麻酸甲酯的主要因素有溶劑、皂化及甲酯化試劑加入量、是否充氮保護(hù)等。同時(shí)，內(nèi)標(biāo)物也是在樣品制備過程中加入，因此同時(shí)考察加入不同內(nèi)標(biāo)物對測定結(jié)果的影響。選取U4(44)表，考察因素及水平見表2，按表3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以 α-亞麻酸含量(Y1)，γ-亞麻酸含量(Y2)，α-亞麻酸甲酯峰峰型和分離度(Y3)，γ-亞麻酸甲酯峰峰型和分離度(Y4)，內(nèi)標(biāo)物峰型及分離度(Y5)為評價(jià)指標(biāo)。

表2 考察因素及水平

表3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 (U4(44))

按“2.1”條下同法采用不同溶劑制備內(nèi)標(biāo)溶液和對照品溶液，依據(jù)表3按“2.1”條下同法制備供試品溶液。按“2.1”條下色譜條件，測定各號實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表4。

表4 均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果

表5 樣品最佳制備條件驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，所得最佳樣品制備工藝結(jié)果較滿意，重現(xiàn)性良好且易于操作，反映了本研究的設(shè)計(jì)方法和技術(shù)路線是科學(xué)、合理、必要和可行的。

3.2 限度范圍 月見草油的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-(-HD-0598)-2002，規(guī)定含γ-亞麻酸不得少于7.5%(g/g)。蘇子油目前無藥品標(biāo)準(zhǔn)，查詢到中華人民共和國糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LS/T3254-2017含α-亞麻酸為56.0%～70.0%。根據(jù)維E三油膠丸的處方，500g維E三油膠丸內(nèi)容物含月見草油125 g，含蘇子油125 g，折算維E三油膠丸中含α-亞麻酸與γ-亞麻酸應(yīng)不少于140.0 mg/g和18.75 mg/g，考慮制劑制備過程的損耗及樣品有效期，擬定維E三油膠丸中含α-亞麻酸與γ-亞麻酸應(yīng)不少于126.0 mg/g和17.0 mg/g。從10批樣品的測定結(jié)果可以看出，10批次樣品含α-亞麻酸和γ-亞麻酸含量均大于限度，說明廠家對月見草油和蘇子油的質(zhì)量控制較好。通過方法學(xué)驗(yàn)證，可以看出，該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于測定維E三油膠丸中蘇子油和月見草油的主要活性成分α-亞麻酸和γ-亞麻酸的含量。