朱斌，關(guān)炳瑜，賀元，阿海，王曉鋒

(西寧市第一人民醫(yī)院，西寧 810000)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是臨床較常見(jiàn)的由創(chuàng)傷引起的嚴(yán)重神經(jīng)損傷疾病，常引起患者出現(xiàn)于損傷平面以下肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙和感覺(jué)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和活動(dòng)能力[1-2]。但目前仍未有對(duì)SCI有顯著效果的治療方法[3]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員之一，對(duì)神經(jīng)具有重要的營(yíng)養(yǎng)作用和促進(jìn)其生長(zhǎng)作用。研究表明[4]，內(nèi)源性NGF在SCI后修復(fù)中有關(guān)鍵作用，其高表達(dá)可促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員之一，目前認(rèn)為其對(duì)神經(jīng)元再生和分化以及神經(jīng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定均有不可替代的作用[5-6]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3(neurotrophin 3，NT3)作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要一員，可以干預(yù)SCI后神經(jīng)修復(fù)抑制因子作用的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，促進(jìn)中樞神經(jīng)的再生，對(duì)SCI后的修復(fù)有重要作用。

電針是中醫(yī)藥領(lǐng)域中的重要治療方法之一，臨床廣泛應(yīng)用于治療SCI，對(duì)SCI引起的運(yùn)動(dòng)功能障礙、感覺(jué)功能障礙以及尿潴留等并發(fā)癥具有良好的治療效果[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，電針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，能促進(jìn)受損神經(jīng)修復(fù)。為進(jìn)一步探討電針對(duì)SCI后神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)和肢體功能恢復(fù)的影響，本實(shí)驗(yàn)觀察電針對(duì)SCI后BDNF、NGF和NT3表達(dá)的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確電針治療SCI的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用36只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，年齡10～12周，體質(zhì)量為(250±30)g，許可證號(hào)碼SCXK(滬)2017-003。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將36只SD大鼠隨機(jī)分為為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組12只。

1.2 主要儀器及試劑

試劑包括兔抗NGF抗體(abcam，美國(guó)，批號(hào)ab6199)、兔抗BDNF抗體(abcam，美國(guó)，批號(hào)ab108319)、羊抗NT3(abcam，美國(guó)，批號(hào)ab7484)、抗體Alexa Fluor 488熒光二抗(賽默飛，美國(guó)，批號(hào)A-27012)、568熒光二抗(賽默飛，美國(guó)，批號(hào)A-11004)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗體(abcam，美國(guó)，批號(hào)ab6721)、驢抗山羊IgG H&L(HRP)抗體(abcam，美國(guó)，批號(hào)ab6885)、尼氏染色液(索萊寶，北京，批號(hào)G1430)，AceQ實(shí)時(shí)定量PCR SYBR Green Master Mix試劑盒(Q111-02/03，維諾贊)、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for實(shí)時(shí)定量PCR(+gDNA wiper)試劑盒(R223-01，維諾贊)；儀器包括NYU脊髓打擊器(W.M.Keck神經(jīng)科學(xué)協(xié)作中心，美國(guó))；0.30 mm×13 mm毫針(華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；醫(yī)用電針治療儀(G6805，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 SCI模型制備

采用7%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，注射劑量為5 mL/kg。麻醉成功后，選擇T9-T11區(qū)域備皮，暴露手術(shù)部位，消毒；沿大鼠后正中線作一長(zhǎng)約2～3 cm縱行切口，分別切開(kāi)皮膚、肌肉、筋膜等軟組織，使用小型咬骨鉗咬除椎板，暴露脊髓；固定大鼠軀體，調(diào)整打擊桿，瞄準(zhǔn)T9-T11節(jié)段脊髓，使10 g的打擊桿自12.5 mm高度落下打擊脊髓，出現(xiàn)大鼠后肢回縮撲動(dòng)及尾部快速擺動(dòng)提示造模成功；0.9%氯化鈉溶液沖洗傷口，逐層縫合。術(shù)后所有大鼠單籠飼養(yǎng)，以木屑保暖，每日2次人工按摩膀胱助其排尿排便。術(shù)后每日大鼠前肢肌肉注射青霉素4萬(wàn)單位，預(yù)防感染。模型組和電針組大鼠均成功制備SCI模型，無(wú)死亡。

1.3.2 干預(yù)方法

手術(shù)后第1天開(kāi)始進(jìn)行干預(yù)。電針組取穴為雙側(cè)肝俞、脾俞穴[11]。具體定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]中的定位方法。將毫針斜刺入上述穴位2 mm。設(shè)置電針儀的電流強(qiáng)度為1～3 mA，頻率為2 Hz，選連續(xù)波，以使大鼠背部肌肉產(chǎn)生輕微抽動(dòng)，同時(shí)使癱瘓的下肢肌肉出現(xiàn)規(guī)律性收縮。每日治療1次，每次20 min，干預(yù)1周后動(dòng)物處死。假手術(shù)組和模型組每日同一時(shí)間同等條件抓取20 min后回籠飼養(yǎng)，不予任何治療。

1.3.3 行為學(xué)評(píng)分

手術(shù)后每日對(duì)所有大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分實(shí)驗(yàn)。根據(jù)大鼠脊髓損傷行為學(xué)評(píng)分(Basso Beattie Bresnahan，BBB)進(jìn)行評(píng)分，判斷SCI后大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙情況。本評(píng)分全程由2名熟悉BBB評(píng)分操作和評(píng)分但未知曉實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡膶?shí)驗(yàn)人員完成，最終分值取2名實(shí)驗(yàn)人員的平均分。

1.3.4 取材

大鼠麻醉后，每組分別隨機(jī)選取6只大鼠采用4%多聚甲醛灌注固定取材，取T9-T11節(jié)段脊髓組織并放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h，用于尼氏染色和免疫組化檢測(cè)；剩余6只大鼠采用直接取材，取T9-T11節(jié)段長(zhǎng)約2 cm的脊髓組織，于-80℃保存，用于Western Blot檢測(cè)和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。

1.3.5 尼氏染色

將5 μm石蠟組織切片脫蠟至入水，使用尼氏染色液在60℃下染色50 min，PBS溶液漂洗，分色液分色2 min，晾干，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察脊髓灰質(zhì)前角區(qū)域并拍片。

1.3.6 免疫熒光檢測(cè)

石蠟組織切片脫蠟至水，修復(fù)，冷卻；經(jīng)PBS洗滌后，用0.3% Triton X-100溶液浸泡10 min；血清室溫封閉1 h，甩掉封閉液不洗；分別滴加NGF一抗(1：200)、BDNF一抗(1：200)和NT3一抗(1：200)，4℃過(guò)夜；次日先將切片復(fù)溫0.5 h，PBS洗滌后在避光環(huán)境下加Alexa Fluor 488或568熒光二抗，37℃烤箱孵育1 h；PBS洗滌，使用抗熒光減退封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察脊髓灰質(zhì)前角區(qū)域，采用Image J軟件識(shí)別視野中免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞并標(biāo)記計(jì)數(shù)，每只大鼠隨機(jī)取6張標(biāo)本進(jìn)行觀察，每張標(biāo)本隨機(jī)取6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)為每只大鼠脊髓灰質(zhì)前角區(qū)域的免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 Western Blot檢測(cè)

將脊髓組織研磨呈糜狀后加入裂解液，冰浴60 min。14000 rp離心10 min，BCA法定量蛋白。計(jì)算蛋白濃度。使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，觀察Marker蛋白的位置。轉(zhuǎn)膜，封閉，漂洗3次。先后加入NGF一抗(1：1000)、BDNF一抗(1：1000)、NT3一抗(1：1000)和山羊抗兔二抗(1：1000)或驢抗山羊二抗(1：1000)。漂洗后去除二抗后使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影。在避光條件下顯影，凝膠掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.3.8 實(shí)時(shí)定量PCR

首先提取總RNA，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為51℃反應(yīng)2 min，96℃預(yù)變性10 min，96℃變性10 s，退火60℃反應(yīng)30 s，40個(gè)循環(huán)。先算出△Ct值，再計(jì)算△△Ct，目的基因的表達(dá)差異為2-△△Ct。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。BBB肢體功能評(píng)分屬于多組多時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測(cè)量資料的分析，同時(shí)不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)；對(duì)于符合正態(tài)分布的結(jié)果采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同干預(yù)時(shí)間BBB評(píng)分比較

重復(fù)測(cè)量資料檢測(cè)分析顯示，各組數(shù)據(jù)之間不符合Mauchly球形檢驗(yàn)(P=0.000)，經(jīng)過(guò)校正結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，時(shí)間效應(yīng)顯示不同時(shí)間點(diǎn)的各組大鼠BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分具有差異性(P＜0.05)；采用非參數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組和電針組術(shù)后BBB評(píng)分顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，電針組自術(shù)后第5天的BBB評(píng)分顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠不同干預(yù)時(shí)間BBB評(píng)分比較

2.2 尼氏染色觀察各組神經(jīng)元形態(tài)

如圖2所示，假手術(shù)組神經(jīng)元形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)豐富的紫褐色尼氏體，細(xì)胞核大，核仁明顯；模型組尼氏體碎裂、形態(tài)細(xì)小，數(shù)量較少，部分神經(jīng)元周?chē)梢?jiàn)明顯的液化空洞；電針組神經(jīng)元形態(tài)較模型組改善，尼氏體形態(tài)較飽滿，數(shù)量較多。

2.3 免疫熒光法檢測(cè)脊髓中BDNF、NGF和NT3陽(yáng)性表達(dá)

如圖3所示，NGF陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，BDNF陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，NT3陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，假手術(shù)組BDNF、NGF和NT3陽(yáng)性細(xì)胞亮度較暗，數(shù)量較少；模型組和電針組BDNF、NGF和NT3陽(yáng)性細(xì)胞亮度較高，數(shù)量較多。

如圖4所示，與假手術(shù)組相比，模型組和電針組BDNF、NGF和NT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組相比，電針組BDNF、NGF和NT3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 Western Bolt檢測(cè)BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表達(dá)情況

如圖5所示，假手術(shù)組的BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表達(dá)量較少，模型組和電針組BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表達(dá)量較多。

如圖6所示，與假手術(shù)組比較，模型組和電針組BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，電針組BDNF蛋白、NGF蛋白和NT3蛋白表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)BDNF mRNA、NGF mRNA和NT3 mRNA表達(dá)情況

如圖7所示，與假手術(shù)組比較，模型組和電針組BDNF mRNA、NGF mRNA和NT3 mRNA表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，電針組BDNF mRNA、NGF mRNA和NT3 mRNA表達(dá)量顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài)(×200)

圖3 免疫熒光檢測(cè)BDNF、NGF和NT-3表達(dá)(×200)

圖4 BDNF、NGF和NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

圖5 Western Blot檢測(cè)BDNF、NGF和NT3蛋白表達(dá)

圖6 各組蛋白相對(duì)表達(dá)量

圖7 各組mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

脊髓損傷是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病，但是目前尚未有理想的治療方法[13]。SCI的損傷程度及治療時(shí)間對(duì)患者的預(yù)后極為重要，特別是早期及時(shí)治療更應(yīng)予以重視[14-15]。脊髓內(nèi)部及外部的微環(huán)境在SCI發(fā)生后發(fā)生了較大的變化，產(chǎn)生眾多復(fù)雜的病理反應(yīng)[16-17]。這些病理反應(yīng)嚴(yán)重阻礙了SCI后神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)。因此，促進(jìn)受損神經(jīng)元及軸突修復(fù)，重建神經(jīng)通路連接被認(rèn)為是治療SCI的重要思路，以有利于SCI患者喪失的神經(jīng)功能得到部分的恢復(fù)[18]。

NGF是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族重要成員，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)過(guò)程中扮演重要角色，可發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)損傷的神經(jīng)和軸突，促進(jìn)損傷的神經(jīng)和軸突的修復(fù)和再生的作用[19]。研究表明[20]，膠質(zhì)細(xì)胞以及脊髓腹側(cè)角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和外周神經(jīng)元中含有豐富的NGF。SCI發(fā)生后，神經(jīng)系統(tǒng)中的上述細(xì)胞內(nèi)的NGF收到靶細(xì)胞基因調(diào)控信號(hào)后開(kāi)始表達(dá)并釋放到細(xì)胞，發(fā)揮促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[21]。除NGF以外，BDNF也是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，對(duì)神經(jīng)元也有促生長(zhǎng)和促修復(fù)的重要作用[22]。神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，BDNF可促進(jìn)損傷神經(jīng)元修復(fù)、再生以及有利于神經(jīng)環(huán)路重建，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。此外，NT3作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的成員，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在，具有調(diào)控神經(jīng)發(fā)育和再生的重要作用。研究表明，一方面，NT3與其受體TrkC結(jié)合可發(fā)揮誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞朝著神經(jīng)元的方向分化，同時(shí)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞朝著功能性神經(jīng)元的方向分化，從而有利于神經(jīng)元的再生[23]；另一方面，NT3具有調(diào)控Bax/Bcl-2表達(dá)的作用，可抑制Bax表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，對(duì)SCI后神經(jīng)元凋亡有抑制作用，從而在SCI后發(fā)揮保護(hù)作用[24]。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[25-27]，多種治療手段可通過(guò)調(diào)控神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平而有利于SCI后神經(jīng)元和軸突的修復(fù)和再生，改善SCI大鼠神經(jīng)功能和運(yùn)動(dòng)功能，降低并發(fā)癥。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI發(fā)生后，大鼠SCI處的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子包括BDNF、NT3和NGF均出現(xiàn)表達(dá)增多的現(xiàn)象。這說(shuō)明在SCI發(fā)生后，損傷組織、細(xì)胞發(fā)出損傷信號(hào)促進(jìn)BDNF、NT3和NGF的表達(dá)以促進(jìn)損傷神經(jīng)元和神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)。但是，由于SCI造成眾多神經(jīng)元死亡，勢(shì)必影響營(yíng)養(yǎng)因子及其受體表達(dá)的增加，使其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)作用和保護(hù)作用受到限制，單靠SCI后內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的自身表達(dá)很難發(fā)揮良好的作用。因此，如何有效調(diào)控SCI后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平是治療SCI的新思路。

SCI多由于跌仆損傷或外傷暴力導(dǎo)致脊髓受損，氣滯血瘀，氣血運(yùn)行不暢，從而出現(xiàn)肌肉痿軟無(wú)力，筋脈萎縮失養(yǎng)，運(yùn)動(dòng)不利，二便失司等癥狀。中醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論認(rèn)為，肝主筋，脾主肉，兩者與肢體運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，肝脾氣血充足，則筋脈肌肉得其所養(yǎng)，筋脈肌肉強(qiáng)健有力，運(yùn)動(dòng)靈活。肝俞穴和脾俞穴為膀胱經(jīng)的背俞穴，與肝脾關(guān)系密切，刺激肝俞穴和脾俞穴有利于調(diào)節(jié)肝臟和脾臟的功能并通調(diào)水道。因此，臨床常選取肝俞穴和脾俞穴用于治療SCI、筋脈肌肉痿軟無(wú)力等病癥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針干預(yù)7 d后，SCI模型大鼠的BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著提升，說(shuō)明電針治療促進(jìn)了SCI后肢體運(yùn)動(dòng)功能在一定程度的恢復(fù)。尼氏染色結(jié)果提示電針組的大鼠脊髓神經(jīng)元形態(tài)優(yōu)于模型組，說(shuō)明電針干預(yù)有利于SCI模型大鼠神經(jīng)元的修復(fù)，這也可能是電針促進(jìn)SCI模型大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的原因之一。同時(shí)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)可顯著促進(jìn)SCI后BDNF、NGF和NT3表達(dá)。鑒于BDNF、NGF和NT3對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)修復(fù)方面的重要作用，本研究認(rèn)為，電針通過(guò)上調(diào)SCI后NGF和BDNF表達(dá)，從而有利于神經(jīng)元修復(fù)和再生，促進(jìn)大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。但是，電針調(diào)控SCI后BDNF、NGF和NT3表達(dá)深入作用機(jī)制仍需后期進(jìn)一步研究。