顏楨靈，李國(guó)萍，駱海玉，陸保屹，梁春霞，鄧業(yè)成，鄧志勇

(珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西珍稀瀕危動(dòng)物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006)

植物內(nèi)生真菌指的是一類(lèi)全部或部分生活史存在于植物健康組織或器官中，卻不引起宿主植物產(chǎn)生明顯感染病癥的微生物[1-2]，其普遍存在于各種植物體中，種類(lèi)繁多，分布廣泛。不同宿主植物不同器官的內(nèi)生真菌種類(lèi)差異較大[3-11]。植物內(nèi)生真菌與宿主植物協(xié)同進(jìn)化、互惠互利，其不僅對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、進(jìn)化及生態(tài)適應(yīng)性產(chǎn)生重要影響，還可以提高宿主植物適應(yīng)惡劣環(huán)境的能力[12]。

隨著傳統(tǒng)化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期大量使用，病蟲(chóng)害的耐藥性日益加重，同時(shí)也引發(fā)水體污染、土壤污染、野生動(dòng)物或人畜中毒等一系列生態(tài)問(wèn)題，因此，尋找環(huán)境友好型的新農(nóng)藥迫在眉睫[13]。而植物內(nèi)生真菌長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化，可產(chǎn)生種類(lèi)豐富、活性顯著的代謝產(chǎn)物，尤其是來(lái)源于藥用植物的內(nèi)生真菌，已成為挖掘新型天然活性物質(zhì)的寶貴資源庫(kù)[14-15]。目前，已有許多研究報(bào)道藥用植物內(nèi)生真菌可產(chǎn)生萜類(lèi)及其皂苷、甾體、生物堿、肽類(lèi)、芳香類(lèi)等具有抗菌、抗蟲(chóng)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性的物質(zhì)[2,16]。內(nèi)生真菌中的活性物質(zhì)，具有可持續(xù)利用、對(duì)自然資源破壞小等優(yōu)點(diǎn)，可緩解自然資源短缺的問(wèn)題，特別是能為保護(hù)珍稀瀕危藥用植物資源提供新思路，是近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)[14]。內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物在植物病蟲(chóng)害生物防治、醫(yī)藥工業(yè)上的用途和范圍逐漸擴(kuò)大[17]。

血散薯(StephaniadielsianaY.C.Wu)，別名金不換、一滴血，為防己科千金藤屬植物，是我國(guó)南部及西南部地區(qū)重要的藥用植物，味苦、性寒，有清熱解毒、活血散瘀、止痛、抗炎、涼血、治療蛇毒咬傷等多種藥理功能[18-20]。此外，其甲醇粗提物及活性物質(zhì)千金藤堿(Stephanine)和克斑寧(Crebanine)等具有顯著、廣譜的抗菌活性[21]。但血散薯僅生長(zhǎng)于廣西、廣東、貴州南部及湖南南部等地的山谷、溪邊、林中及峭壁上，分布范圍窄，資源有限，加之人們?nèi)狈?duì)血散薯的保護(hù)意識(shí)，近年來(lái)過(guò)度采挖，已造成該資源的嚴(yán)重稀缺?；诠采碚?，認(rèn)為血散薯內(nèi)生真菌可能具有多種生物活性。目前，對(duì)血散薯內(nèi)生真菌的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究從血散薯莖、葉中分離純化內(nèi)生真菌，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并探究其次生代謝產(chǎn)物的抗菌活性，以期為血散薯植物資源的保護(hù)及其內(nèi)生真菌的合理開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 血散薯

2016年8月于廣西來(lái)賓市金秀瑤族自治縣(E109°59′34″，N24°16′10″)，采集血散薯新鮮健康莖、葉組織，標(biāo)本保存于廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試病原菌

供試植物病原真菌：選取9種常見(jiàn)農(nóng)業(yè)植物病原真菌作為供試菌株，包括貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)、金橘砂皮病菌(Diaporthecitri)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、水稻胡麻葉斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.Nicotianae)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)。以上9種植物病原真菌除金橘砂皮病菌和貢柑鏈格孢菌由廣西特色作物研究所提供以外，其余7種均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室提供。

供試動(dòng)物病原細(xì)菌：選取10種供試動(dòng)物病原細(xì)菌作為供試菌株，包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。以上10種動(dòng)物病原菌均由桂林醫(yī)學(xué)院提供，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 培養(yǎng)基

內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、氯霉素200 mg/L、瓊脂15 g/L、蒸餾水1 L。

植物病原真菌以及內(nèi)生真菌純化培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 L。

動(dòng)物病原細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 L。

種子液體培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、氯霉素200 mg/L、蒸餾水1 L。

內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基為大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米∶水約為1∶1(m/V)。

1.4 內(nèi)生真菌分離與純化

參考LUO等[22]、王利娟等[23]的方法，對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行分離純化。首先選取新鮮的血散薯莖、葉組織，用清水洗凈表面，吸干表面殘留水分，再按以下步驟進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離：(1)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作，將血散薯莖、葉組織切片(段)。(2)將切片(段)后的血散薯組織進(jìn)行表面消毒。先用75%乙醇漂洗30 s，轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中，沖洗3～4次后，放置在無(wú)菌濾紙上將多余水分吸干。再用2%次氯酸鈉漂洗90 s，轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中，沖洗3～4次后，放置在無(wú)菌濾紙上將多余水分吸干。最后用0.1%氯化汞漂洗3 s，無(wú)菌水沖洗3～4次后，放置在無(wú)菌濾紙上將多余水分吸干。(3)在每個(gè)用PDA培養(yǎng)基制作的平板上放入3～4塊已進(jìn)行過(guò)表面消毒的組織片(段)。設(shè)置2組對(duì)照：一組取最后一次漂洗的無(wú)菌水100 μL加至新鮮無(wú)菌PDA平板上，涂布，逐日觀察平板上是否有菌長(zhǎng)出；另一組采用按壓法，將消毒后的組織塊放在新鮮無(wú)菌PDA平板上，稍加按壓，放置20 min后移去組織塊。每組處理設(shè)置3個(gè)平行，以驗(yàn)證血散薯表面消毒是否徹底，若無(wú)菌長(zhǎng)出，則可以斷定分離出的真菌來(lái)自血散薯莖、葉組織內(nèi)部。(4)分離組織在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，(28±1)℃暗培養(yǎng)1～25 d，逐日觀察。待分離組織邊緣長(zhǎng)出菌絲后及時(shí)挑取，將其轉(zhuǎn)入另一PDA平板培養(yǎng)，重復(fù)操作，直至長(zhǎng)出的菌落形態(tài)完全一致。

1.5 內(nèi)生真菌鑒定

主要采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定。

形態(tài)學(xué)鑒定：參考文獻(xiàn)[24]以及廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)生態(tài)實(shí)驗(yàn)室已鑒定至屬種的多種內(nèi)生真菌菌株等的鑒定方法，采用不同培養(yǎng)基(PDA、CMA、NGA)對(duì)分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。鑒定特征包括菌落大小、形態(tài)、生長(zhǎng)速率、菌落及培養(yǎng)基基質(zhì)顏色、菌落邊緣特征，以及菌落在顯微鏡下的特征(如菌絲有無(wú)分隔、分支，分生孢子形態(tài)、大小，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征等)。

分子生物學(xué)鑒定：利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)段的特性，即具有保守性和特異性序列的特性，通過(guò)內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列對(duì)其進(jìn)行鑒定。以真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增菌株ITS堿基序列，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行檢測(cè)純化及測(cè)序。將所獲得的測(cè)序結(jié)果與NBCI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇相似度較高的菌株，進(jìn)行同源性比對(duì)，并用MEGA Ⅹ軟件，對(duì)ITS堿基序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，利用Bootstrap進(jìn)行自展次數(shù)為1 000的置信度檢測(cè)，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的組群關(guān)系對(duì)菌株進(jìn)行分類(lèi)。

1.6 內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)及粗提物制備

在超凈工作臺(tái)上，用直徑為4 mm的打孔器在已經(jīng)活化好的菌落邊緣處打孔，取3塊菌餅接種至含有馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(150 mL)的錐形瓶(250 mL)中，置于恒溫?fù)u床上，(27±1)℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，即可得到發(fā)酵種子液。取5 mL種子液接種于事先準(zhǔn)備好的大米培養(yǎng)基，放置培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)2個(gè)月。

將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥、粉碎處理后，用適量的乙酸乙酯分別浸泡提取3次，合并3次的提取濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，即得到次生代謝產(chǎn)物粗提物。

1.7 抗植物病原真菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[21]測(cè)定內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物抗植物病原真菌活性。具體操作：樣品用丙酮配成2.5 mg/mL藥液，將藥液(對(duì)照用丙酮代替)與溫度為50～55 ℃的PDA培養(yǎng)基按1∶9混合均勻后，倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，冷凝制成帶毒培養(yǎng)基后，每皿分別接種3塊已活化好的直徑為4 mm的供試病原菌菌餅(甘蔗鳳梨病菌每皿接1塊)，帶菌絲面朝下貼至培養(yǎng)基表面。每處理3次重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，取平均值，計(jì)算抑菌率：抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.4 cm)×100%。測(cè)定對(duì)植物病原菌菌絲體的有效中濃度(EC50)時(shí)，根據(jù)初篩時(shí)的抑菌率，配制系列不同濃度的藥液，測(cè)定其對(duì)供試病原真菌的菌絲毒力，用最小二乘法求出毒力回歸方程、EC50等。

1.8 抗動(dòng)物病原細(xì)菌活性測(cè)定

先采用濾紙片法進(jìn)行抗細(xì)菌活性初篩，再以帶毒平板法測(cè)定活性樣品的最低抑制濃度(MIC)。

濾紙片法：參考林洋等[25]的濾紙片法進(jìn)行抗細(xì)菌活性初篩，具體操作：將熱熔的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，冷凝備用。用西林瓶制備供試病原細(xì)菌懸液，從培養(yǎng)24 h的細(xì)菌培養(yǎng)基中用接種環(huán)刮取適量細(xì)菌與無(wú)菌水進(jìn)行充分混勻，再用移液槍吸取0.1 mL菌液加至培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂布均勻，制成表面含菌培養(yǎng)基。樣品用丙酮溶解并配成10.0 mg/mL藥液，將直徑為6 mm完好的濾紙片浸入藥液(對(duì)照以丙酮代替)5 min，取出晾干。將濾紙片貼入平板內(nèi)適當(dāng)位置，小心用鑷子壓平，使整個(gè)圓形濾紙片與培養(yǎng)基表面貼合，放入37 ℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用十字交叉法測(cè)抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈大小，將抑菌效果分為如下幾類(lèi)：抑菌圈直徑為0 mm者為不敏感；小于10 mm者為輕度敏感；10～15 mm者為中度敏感；大于15 mm者為高度敏感[26]。

MIC值測(cè)定：參考DENG等[21]的方法測(cè)定樣品MIC值。用丙酮將樣品溶解并配成系列濃度藥液，將藥液(對(duì)照用丙酮代替)與溫度為50～55 ℃的熱溶牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按1∶9混合均勻后，倒入直徑為6 cm的培養(yǎng)皿(5 mL/皿)，待凝固后，吸取50 μL菌懸液至培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂布均勻。每處理重復(fù)3次，于(37±1)℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 血散薯內(nèi)生真菌的分離與鑒定

從血散薯莖、葉組織共分離得到38株內(nèi)生真菌，其中31株基于ITS序列的BLAST比對(duì)結(jié)果(表1)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將其歸為14個(gè)屬：鏈格孢屬(Alternaria)、炭團(tuán)菌屬 (Hypoxylon)、枝孢屬(Cladosporium)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma)、鐮刀屬(Fusarium)、Stagonosporopsis、Ascomycete、毛殼菌屬(Chaetomium)、擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsis)、彎孢霉屬(Curvularia)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Annulohypoxylon、小光殼屬(Leptosphaerulina)、刺盤(pán)孢屬(Colletotrichum)。鑒定結(jié)果表明，31株內(nèi)生真菌中鏈格孢屬和莖點(diǎn)霉屬為優(yōu)勢(shì)屬，在莖、葉組織中均有分布。其中，鏈格孢屬13株，莖點(diǎn)霉屬4株，表明其可能是血散薯莖、葉中穩(wěn)定存在的內(nèi)生真菌。其次為彎孢霉屬和鐮刀屬，各2株，其余10個(gè)屬的內(nèi)生真菌均僅分離得到1株。

表1 31株血散薯內(nèi)生真菌ITS序列BLAST比對(duì)結(jié)果Tab.1 ITS sequences BLAST alignment results of 31 endophytic fungi of Stephania dielsiana

續(xù)表1 31株血散薯內(nèi)生真菌ITS序列BLAST比對(duì)結(jié)果Tab.1(Continued) ITS sequences BLAST alignment results of 31 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu

2.2 血散薯內(nèi)生真菌對(duì)9種植物病原真菌的抗菌活性

基于對(duì)峙拮抗預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，從上述38株內(nèi)生真菌中選取表1中的13株及未測(cè)序的YB-20，共14株真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并進(jìn)一步測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物抗植物病原真菌活性，結(jié)果如表2所示。在藥液質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，14株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的粗提物對(duì)9種植物病原真菌具有不同程度的抑制作用。除內(nèi)生真菌J-26、Y-64外，其余內(nèi)生真菌的粗提物均至少對(duì)1種供試植物病原真菌的抑菌率達(dá)到50%以上。其中，Y-66對(duì)9種植物病原真菌的抑菌率均在55%以上，抑菌率介于56.81%～100.00%，表現(xiàn)出較為廣譜的抗菌活性。內(nèi)生真菌葉-8和J-12對(duì)除了茶輪斑病菌以外的8種供試植物病原真菌的抑菌率均在50%以上。其中，葉-8對(duì)金橘砂皮病菌抑菌率為88.56%，J-12對(duì)煙草黑脛病菌抑菌率則達(dá)到100.00%。YB-12對(duì)除了辣椒炭疽病菌和茶輪斑病菌外的7株供試植物病原真菌的抑菌率均在60%以上，對(duì)甘蔗鳳梨病菌、水稻胡麻葉病菌及煙草黑脛病菌的抑制作用最佳，抑菌率均為100.00%。內(nèi)生真菌J-34、J-36和J-55均對(duì)其中5株供試植物病原真菌的抑菌率在60%以上。上述結(jié)果表明，血散薯內(nèi)生真菌具有較好的抗植物病原真菌活性，其中7株內(nèi)生真菌(葉-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36、J-55)的抗菌活性較為明顯和廣譜。

表2 14株血散薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)9種植物病原真菌的抑制作用Tab.2 Antifungal activity of the extracts of 14 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu against 9 plant pathogenic fungi %

2.3 血散薯內(nèi)生真菌對(duì)9種植物病原真菌菌絲的毒力

為確定以上7株活性菌株(葉-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36、J-55)的抗真菌活性，結(jié)合以上抗菌活性測(cè)定結(jié)果，選取該7株活性內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)植物病原真菌抑菌率達(dá)到50%以上的相應(yīng)病原菌作為供試菌株，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)供試菌株菌絲的毒力，結(jié)果見(jiàn)表3。葉-8粗提物對(duì)玉米大斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、貢柑鏈格孢菌、金橘沙皮病菌、煙草黑脛病菌具有較好的毒力，EC50值介于0.048 0～0.363 5 mg/mL，均小于0.5 mg/mL，其中，對(duì)玉米大斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、金橘砂皮病菌具有較好的抗菌活性，其EC50值分別為0.063 1、0.059 5、0.048 0 mg/mL，均小于0.1 mg/mL。Y-66粗提物對(duì)其中6株供試植物病原真菌的EC50值介于0.133 3～0.679 0 mg/mL，其中，對(duì)甘蔗鳳梨病菌具有最好的抗菌活性，EC50值為0.133 3 mg/mL。J-12粗提物對(duì)其中5株供試植物病原真菌的EC50值介于0.006 2～0.700 3 mg/mL，其中，對(duì)金橘砂皮病菌具有最好的抗菌活性，EC50值為0.006 2 mg/mL。YB-12粗提物對(duì)其中6種供試植物病原真菌的EC50值小于1.0 mg/mL，介于0.115 7～0.615 4 mg/mL，其中，對(duì)甘蔗鳳梨病菌具有最好的抗菌活性，EC50值為0.115 7 mg/mL。J-34粗提物對(duì)供試的5株植物病原真菌的EC50值介于0.004 2～0.522 6 mg/mL，其中，對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、貢柑鏈格孢菌均具有極好的抗菌活性，EC50值分別為0.018 1、0.004 2、0.084 6 mg/mL。J-36粗提物對(duì)玉米大斑病菌、貢柑鏈格孢菌的抗菌活性較好，EC50值分別為0.964 9、0.709 0 mg/mL。J-55粗提物對(duì)其中3種植物病原菌的EC50值小于1.0 mg/mL，其中，對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌具有最好的抗菌活性，EC50值為0.280 8 mg/mL。

表3 7株血散薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)植物病原真菌菌絲的毒力Tab.3 Toxicity of the extracts of 7 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu to mycelium of plant pathogenic fungi

2.4 血散薯內(nèi)生真菌對(duì)2種動(dòng)物病原細(xì)菌的抗菌活性

采用濾紙片法對(duì)2.2中14株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物的抗動(dòng)物病原細(xì)菌活性進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)該14株內(nèi)生真菌具有一定抗菌活性。為進(jìn)一步確定其抗菌作用，采用帶毒培養(yǎng)基法測(cè)定其抗菌活性。當(dāng)藥液質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時(shí)，有10株內(nèi)生真菌對(duì)至少1種動(dòng)物病原細(xì)菌具有抗菌活性(表4)。進(jìn)一步測(cè)定其MIC值，發(fā)現(xiàn)10株內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值介于0.500～10.000 mg/mL，其中，YB-25對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性最好，MIC值為0.500 mg/mL。僅有4株內(nèi)生真菌(葉-8、YB-20、J-12、J-17)對(duì)大腸桿菌具有抗菌活性，MIC值介于0.156～4.000 mg/mL，其中，J-12對(duì)大腸桿菌的抗菌活性最佳，MIC值為0.156 mg/mL。葉-8、YB-20、J-12、J-17對(duì)2種供試動(dòng)物病原細(xì)菌具有較好抑制作用。總體來(lái)看，內(nèi)生真菌J-12發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)10種動(dòng)物病原細(xì)菌中的2種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)抑制作用相對(duì)較好(MIC值分別為1.250、0.156 mg/mL)，明顯高于已報(bào)道的血散薯甲醇提取物對(duì)2種供試動(dòng)物病原菌的抗菌活性(MIC值分別為3.75、7.50 g/L)，并高于Stephanine和Crebanine對(duì)大腸桿菌的抗菌活性(MIC值均大于5 g/L)[21]。

表4 10株血散薯內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物抗動(dòng)物病原細(xì)菌的活性Tab.4 Antibacterial activities of the extracts of 10 endophytic fungi of Stephania dielsiana Y.C.Wu against animal pathogenic bacteria

注：---表示未長(zhǎng)菌；+++表示長(zhǎng)菌；/表示無(wú)抗菌活性。

Notes: --- indicates no bacteria; +++ indicates expressing bacteria; /indicates no antibacterial activities.

3 結(jié)論與討論

本研究首次報(bào)道了血散薯內(nèi)生真菌的分離鑒定及其抗菌活性。從血散薯莖葉中共分離得到38株內(nèi)生真菌，其中31株已通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法鑒定，將其歸為14個(gè)屬。其中，優(yōu)勢(shì)屬為鏈格孢屬和莖點(diǎn)霉屬，在莖、葉組織中均有分布，表明其可能是血散薯莖葉中穩(wěn)定存在的內(nèi)生真菌。鏈格孢屬和莖點(diǎn)霉屬在已報(bào)道的許多植物內(nèi)生真菌中也均為優(yōu)勢(shì)屬[22,27-28]，可見(jiàn)鏈格孢屬和莖點(diǎn)霉屬是植物中普遍存在的內(nèi)生真菌。

經(jīng)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物粗提物抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，分離得到的大部分血散薯內(nèi)生真菌具有良好而廣譜的抗菌活性。其中，抗植物病原真菌活性的研究結(jié)果表明，7株內(nèi)生真菌(葉-8、Y-66、YB-12、J-12、J-34、J-36和J-55)均具有較為明顯和廣譜的抗植物病原真菌活性。而在抗動(dòng)物病原細(xì)菌方面的研究結(jié)果表明，10株供試內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌均具有抗菌活性，但僅有4株內(nèi)生真菌對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出抗菌活性。以上結(jié)果與前人[21]報(bào)道的血散薯植物抗菌活性相似，即血散薯甲醇粗提物及其活性成分Stephanine和Crebanine對(duì)植物病原真菌具有明顯而廣譜的抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌均具有不同程度的抑制作用，而對(duì)大腸桿菌的抗菌活性較差。

本研究結(jié)果表明，血散薯莖、葉組織中存在豐富的內(nèi)生真菌資源，且其次生代謝產(chǎn)物含有廣譜抗菌活性物質(zhì)。后期可對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，以尋找活性化合物等，為生物源殺菌劑的創(chuàng)制提供更多優(yōu)秀的先導(dǎo)化合物，同時(shí)也將為活性天然產(chǎn)物提供重要的資源，并對(duì)其在農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。