華 夏，方宇輝，高 崇，韓留鵬，胡 琳，李 艷

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 小麥研究所，河南 鄭州 450002)

磷素是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的大量元素之一，它不僅是植物體內(nèi)許多重要化合物的組分，而且還以多種途徑參與各種代謝過程，在農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。目前，為了提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，磷肥的施用量逐年增加。然而，土壤中的磷素和施入土壤中的磷素80%被固定，變?yōu)殡y于被植物吸收的難溶態(tài)和有機(jī)態(tài)磷[1-2]。一般情況下，植物以吸收無機(jī)磷為主，而無機(jī)磷中可被直接吸收利用的有效磷含量占總無機(jī)磷含量的比例低于0.5%[3]，導(dǎo)致磷肥當(dāng)季利用率低下。磷肥的過度施用不但增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，還給生態(tài)環(huán)境帶來了眾多隱患。小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，在生產(chǎn)中普遍面臨著土壤有效磷不足的問題。因此，發(fā)掘耐低磷脅迫基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制磷高效吸收利用的小麥新種質(zhì)，進(jìn)而快速選育出磷高效小麥新品種，對(duì)于充分利用土壤磷素資源、減少肥料浪費(fèi)、防止環(huán)境污染和促進(jìn)小麥生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前，許多耐低磷脅迫轉(zhuǎn)錄因子已從擬南芥、水稻等植物中克隆出來。PHR1(Phosphate starvation response 1)和PHR2都屬于MYB-CC(V-mybavian myeloblastosis viral oncogene homolog and coiled-coil)家族成員，是植物響應(yīng)低磷脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，轉(zhuǎn)小麥TaPHR1基因的小麥在低磷脅迫條件下的產(chǎn)量顯著高于野生型對(duì)照[4]。水稻耐低磷脅迫基因OsPHR2通過調(diào)節(jié)磷饑餓誘導(dǎo)基因PSI(Phosphate starvation-induced)的表達(dá)而參與磷饑餓信號(hào)傳導(dǎo)，OsPHR2過表達(dá)使PSI基因表達(dá)增強(qiáng)，從而提高了轉(zhuǎn)基因植株葉鞘中磷的積累量[5-7]。在低磷條件下，過量表達(dá)OsPHR2基因可提高植物根系對(duì)低磷信號(hào)的響應(yīng)，根構(gòu)型的改變較野生型對(duì)照更明顯，根長(zhǎng)增長(zhǎng)，根毛增多，磷吸收利用率顯著提高[8]。OsPHR2是水稻磷信號(hào)調(diào)控體系的重要轉(zhuǎn)錄因子，在土壤缺磷條件下可顯著提高植物對(duì)磷的吸收[8-9]。目前，關(guān)于OsPHR2基因轉(zhuǎn)化小麥及對(duì)小麥耐低肥能力的影響研究還未見報(bào)道。為此，利用基因槍法，首次將OsPHR2基因?qū)牒幽鲜〈竺娣e推廣的小麥品種和高代品系中，分析不同基因型小麥的轉(zhuǎn)化效率和OsPHR2基因在小麥中的遺傳穩(wěn)定性，并分析轉(zhuǎn)基因小麥的耐低肥能力及產(chǎn)量相關(guān)性狀，以期為小麥養(yǎng)分高效利用育種提供材料基礎(chǔ)和理論支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

供試小麥品種(系)為鄭麥1836、鄭麥6687、鄭麥7698、鄭麥1342、鄭麥6694、鄭麥9188。

OsPHR2和Bar(雙丙氨膦抗性)基因的線性轉(zhuǎn)化片段如圖1所示。這2個(gè)轉(zhuǎn)化片段均是利用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶分別酶切環(huán)狀表達(dá)載體 pWMB003-OsPHR2和pSBar，并通過膠回收而獲得。線性轉(zhuǎn)化片段只含有啟動(dòng)子[玉米Ubi(Ubiquitin)啟動(dòng)子]、目標(biāo)基因和終止子(Nos終止子)，不含有任何載體骨架序列。所有供試材料和OsPHR2、Bar基因表達(dá)載體均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所分子育種研究室提供。

圖1 OsPHR2和Bar基因線性表達(dá)載體片段Fig.1 Fragment of OsPHR2 and Bar gene linear expression vectors

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖；高滲培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基+0.4 mol/L甘露醇；分化培養(yǎng)基：MS+1 mg/L激動(dòng)素+0.5 mg/L萘乙酸+5 mg/L草銨膦+30 g/L蔗糖；生根培養(yǎng)基：1/2 MS+0.2 mg/L萘乙酸+30 g/L蔗糖。在每種培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂粉，pH值調(diào)節(jié)為5.8，高溫高壓滅菌。其中,草銨膦經(jīng)過濾除菌，再加入滅菌后溫度降至50 ℃左右的培養(yǎng)基中。

1.3 小麥遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)OsPHR2基因植株的獲得

于小麥開花后12～15 d，取小麥穗，將被覆白毛的幼嫩種子在無菌條件下進(jìn)行消毒，剝?nèi)∮着呓臃N于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)室內(nèi)暗培養(yǎng)3～5 d，轉(zhuǎn)移至高滲培養(yǎng)基(6 cm培養(yǎng)皿中央2.5 cm直徑范圍內(nèi))滲透處理4～6 h，然后采用基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織，具體參照李艷等[10-11]的方法，將含有OsPHR2和Bar的2個(gè)獨(dú)立線性表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化至6個(gè)供試受體材料中。然后將小麥愈傷組織暗培養(yǎng)14 d，之后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，利用草銨膦進(jìn)行2～3輪篩選，將獲得的抗性幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，通過壯苗、煉苗后移栽入河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院智能溫室中。

1.4 轉(zhuǎn)OsPHR2基因植株的PCR檢測(cè)

待轉(zhuǎn)OsPHR2基因T0植株長(zhǎng)到三葉一心期，利用CTAB法[12]提取植株葉片基因組DNA，分別對(duì)目的基因OsPHR2和選擇標(biāo)記基因Bar進(jìn)行PCR檢測(cè)。

選擇標(biāo)記基因Bar為草銨膦抗性基因，其檢測(cè)引物為FBP1：5′-CCATCGTCAACCACTACATC-3′，RBP2：5′-ATGCCAGTTCCCGTGCTTGA-3′，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為408 bp。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：2×TaqPCR StarMix with Loading Dye(GenStar)10 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL、200～600 ng 的DNA 模板1 μL，補(bǔ)加ddH2O至20 μL 。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

目的基因OsPHR2檢測(cè)引物為 FPP1：5′-AATATGGAGGCTTTGAACC-3′，RPP2：5′-TAACACACCCTTGGGAGTA-3′，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為476 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×TaqPCR StarMix with Loading Dye(GenStar)10 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL、200～600 ng 的DNA 模板1 μL，補(bǔ)加ddH2O至20 μL 。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 高肥和低肥條件下轉(zhuǎn)OsPHR2基因植株的產(chǎn)量性狀調(diào)查

2018年10月將T1轉(zhuǎn)基因小麥種植于國(guó)家黃淮海轉(zhuǎn)基因小麥中試與產(chǎn)業(yè)化基地，試驗(yàn)設(shè)置高肥和低肥2個(gè)肥力水平(表1)，常規(guī)大田管理。收獲期，取自然風(fēng)干的T1轉(zhuǎn)基因株系和野生型對(duì)照各20株，調(diào)查單株穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量和單株生物量。

表1 高、低肥處理土壤基礎(chǔ)肥力和肥料施用量Tab.1 The soil basic fertility and fertilizer application amount of high and low fertility treatment

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥的獲得

通過基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將OsPHR2和Bar共轉(zhuǎn)化鄭麥1836、鄭麥6687、鄭麥7698、鄭麥1342、鄭麥6694、鄭麥9188，為獲得只含有OsPHR2基因、不含Bar和任何載體序列的轉(zhuǎn)基因小麥株系提供了最大的可能性，愈傷組織的誘導(dǎo)、分化、篩選和抗性苗的獲得如圖2所示。

2.2 轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥T0植株的PCR檢測(cè)

利用PCR方法對(duì)抗性植株中目的基因OsPHR2和Bar進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有180株抗性植株均含有OsPHR2和Bar基因(圖3—4)，其中，鄭麥1836有56株，鄭麥6687有38株，鄭麥7698有17株，鄭麥1342有27株，鄭麥6694有32株，鄭麥9188有10株，野生型對(duì)照均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。初步證明目的基因OsPHR2已整合到小麥基因組中。

A：愈傷組織的誘導(dǎo)； B：愈傷組織的分化； C：抗性苗的篩選； D：抗性苗的移栽

M：D2000 Marker； 1：陽性對(duì)照； 2：野生型對(duì)照； 3：空白對(duì)照； 4—14：轉(zhuǎn)化植株

M：D2000 Marker； 1：陽性對(duì)照； 2：野生型對(duì)照； 3：空白對(duì)照； 4—14：轉(zhuǎn)化植株

從表2可以看出，從6個(gè)受體材料中共篩選到1 135株抗性再生植株，受體鄭麥1836、鄭麥6687、鄭麥7698、鄭麥1342、鄭麥6694、鄭麥9188的陽性率分別為3.32%、3.51%、6.83%、4.41%、3.78%、1.16%。說明不同基因型小麥的轉(zhuǎn)化率存在差異，鄭麥7698的轉(zhuǎn)化率最高，鄭麥9188最低。

表2 基因槍轉(zhuǎn)化不同基因型小麥的轉(zhuǎn)化率Tab.2 The transformation efficiency of different wheat genotypes by particle bombardment

注：陽性率=(PCR檢測(cè)陽性植株數(shù)/轟擊幼胚總數(shù))×100%。

Notes: Positive rate=Positive plant number by PCR detection/Bombarded embryo number×100%.

2.3 轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥的遺傳分析

對(duì)從轉(zhuǎn)OsPHR2基因T0陽性植株中獲得的T1株系的OsPHR2基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，并根據(jù)PCR結(jié)果對(duì)部分株系的分離比進(jìn)行適合度測(cè)驗(yàn)。從表3可以看出，鄭麥7698和鄭麥1342轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥T1共16個(gè)株系，其中，有15個(gè)株系的分離比與預(yù)期的比例(3∶1)差異不顯著，符合孟德爾單基因遺傳分離規(guī)律，鄭麥7698轉(zhuǎn)基因株系T-301的分離比與預(yù)期比例差異顯著。上述結(jié)果初步表明，外源基因OsPHR2已整合到小麥基因組中，并能夠穩(wěn)定遺傳。

表3 轉(zhuǎn)OsPHR2基因T1小麥的遺傳分析Tab.3 Genetic analysis of OsPHR2-overexpressing T1 transgenic wheat

2.4 轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥T1植株的農(nóng)藝性狀分析

從表4可以看出，在2種肥力條件下轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥的單株產(chǎn)量均較野生型對(duì)照增加，但高肥條件下增加不顯著；低肥條件下，鄭麥7698和鄭麥1342轉(zhuǎn)OsPHR2基因小麥的平均單株產(chǎn)量分別較對(duì)照增加9.27%和11.06%，增產(chǎn)的原因主要是千粒質(zhì)量和穗粒數(shù)總體均顯著增加。另外，在2種肥力水平下，鄭麥7698轉(zhuǎn)基因小麥的單株生物量均較野生型對(duì)照顯著增加。說明低肥條件下OsPHR2基因可以提高轉(zhuǎn)基因小麥的養(yǎng)分利用效率。

表4 轉(zhuǎn)OsPHR2基因T1小麥植株農(nóng)藝性狀分析Tab.4 Analysis of agronomic characters of OsPHR2-overexpressing T1 transgenic wheat plants

注： *代表轉(zhuǎn)基因株系與野生型對(duì)照的差異顯著(P<0.05)。

Notes:* indicates significant difference between transgenic plants and wild type plants (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

基因槍介導(dǎo)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的成功與否受基因型、外植體類型以及轟擊參數(shù)等多個(gè)因素的影響。其中，基因型對(duì)組織脫分化再生的決定性作用已被廣泛認(rèn)可[13]。為篩選到優(yōu)良的小麥基因型受體材料，許多學(xué)者開展了大量研究。栗聰?shù)萚14]從196個(gè)黃淮地區(qū)小麥推廣品種(系)中篩選到10個(gè)與對(duì)照Bobwhite相似或具有更高組培再生能力的品種(系)。蔣云等[15]從21 份四川省優(yōu)良小麥品種(系)中篩選到5份適宜農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的基因型，豐富了西南麥區(qū)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的基因型受體材料。篩選再生能力強(qiáng)而且農(nóng)藝性狀良好的基因型作為轉(zhuǎn)化受體，對(duì)小麥的遺傳改良研究具有重要意義。鄭麥1836、鄭麥6687、鄭麥7698、鄭麥1342、鄭麥6694、鄭麥9188是河南省大面積推廣品種、苗頭品系，且具有較優(yōu)的農(nóng)藝性狀。本研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型遺傳轉(zhuǎn)化率存在明顯差異，鄭麥7698和鄭麥1342的遺傳轉(zhuǎn)化率高于其他受體材料。同時(shí)，鄭麥7698和鄭麥1342是在生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種。因此，利用鄭麥7698和鄭麥1342作為轉(zhuǎn)基因受體材料，可快速培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、節(jié)本的轉(zhuǎn)基因小麥新品種。

根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)轉(zhuǎn)OsPHR2基因部分T1株系的分離比進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)，結(jié)果顯示大部分株系符合孟德爾單基因遺傳分離規(guī)律，證明OsPHR2已整合到小麥基因組中并在后代中能夠穩(wěn)定遺傳，但有個(gè)別株系偏離此規(guī)律，這是轉(zhuǎn)基因T1普遍存在的現(xiàn)象，與前人研究結(jié)果類似[16-17]。由于大部分T0植株收獲的種子數(shù)量較少，本研究檢測(cè)T1植株數(shù)目受限，外源基因能否在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，還需在T2、T3以及更高世代，利用較大的樣本群體，并結(jié)合拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)等進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳分析。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在低肥條件下過表達(dá)OsPHR2的轉(zhuǎn)基因小麥總體上顯著增加了穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量，最終單株產(chǎn)量顯著提高。前人在轉(zhuǎn)基因擬南芥[18-19]、水稻[8]、大豆[20]的研究中發(fā)現(xiàn)，OsPHR2基因的過表達(dá)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)磷的吸收能力，抑制磷素從老葉向幼葉的轉(zhuǎn)運(yùn)再利用，改善根構(gòu)型，增加百粒質(zhì)量及籽粒蛋白質(zhì)含量，這些可能與OsPHR2基因調(diào)控磷信號(hào)與磷吸收的3條途徑[21]有密切關(guān)系，分別為OsPHR2基因可以直接調(diào)控低親合磷轉(zhuǎn)運(yùn)體OsPT2(OryzasativaL. phosphate transporter 2)，OsPHR2基因可通過調(diào)控IPS1-MiR399-PHO2(Inositol-1-phosphatesynthase-microRNA399-phosphate over-accumulator 2)途徑調(diào)控低親合和高親合磷轉(zhuǎn)運(yùn)體PHR2-PHO-PT(Phosphate starvation response 2-phosphate over-accumulator-phosphate transporter)途徑，OsPHR2基因調(diào)控磷轉(zhuǎn)運(yùn)體受OsPHF1(OryzasativaL. phosphate transporter traffic facilitator 1)的控制，下一步將對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。