劉 鑫，趙 穎，王永潔，劉欣妍，劉 葭，吳 清

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

肺癌在所有腫瘤中是最主要的致死因素，已成為全球共同面對和急需解決的公共衛(wèi)生問題之一[1]。肺癌病死率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類健康并加重社會負(fù)擔(dān)[2]。目前，西醫(yī)臨床上多采用化療的方法進(jìn)行治療[3]，但化療的同時，患者的正常細(xì)胞也會受到損傷，不良反應(yīng)較大，因此肺癌患者進(jìn)行化療時，臨床上多采用中藥復(fù)方進(jìn)行輔助治療[4]。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪和當(dāng)歸兩味中藥組成，出自李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，是補(bǔ)氣生血的經(jīng)典名方[5-6]。方中黃芪補(bǔ)脾肺之氣，固護(hù)肌表，為君藥；當(dāng)歸養(yǎng)血和營，為臣藥，兩藥配伍，共奏補(bǔ)氣生血之功效[7]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有黃酮類、多糖類及揮發(fā)油類成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有改善血液系統(tǒng)疾病、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、促進(jìn)血管生成、抗腫瘤等藥理作用[8-9]。亦有臨床報道用當(dāng)歸補(bǔ)血湯及其加減方作為肺癌化療時的輔助用藥[10-11]，但當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的具體機(jī)制仍然不清晰。

由于中藥具有多成分、多靶點的特點，為研究中藥治療某種疾病的作用機(jī)制增添了難度，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)促進(jìn)了中藥作用機(jī)制的研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析學(xué)及計算生物學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和內(nèi)容，通過構(gòu)建“疾病-表型-基因-藥物”的多層次結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)水平上揭示藥物與疾病之間的關(guān)系，其系統(tǒng)性、整體性的思想與中醫(yī)中藥辨證論治、協(xié)同作用理念不謀而合[12-14]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對當(dāng)歸補(bǔ)血湯多成分、多靶點與肺癌的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行分析，旨在揭示當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的作用機(jī)制，為其應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 方法

1.1 研究思路 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的實驗思路見圖1。

1.2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分的收集和篩選 本實驗利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//lsp．nwu．edu．cn/tcmsp．php）[15]，分別以“黃芪”“當(dāng)歸”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，檢索當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的所有化學(xué)成分。將篩選條件設(shè)置為 OB≥30%，DL≥0．18[16]，篩選出當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的活性成分。

圖1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法示意圖Fig.1 Work schemeof network pharmacology approach of Danggui Buxue Decoction in ad juvant treatment of lung cancer

1.3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯成分靶點的垂釣 利用中藥成分靶點數(shù)據(jù)庫（HIT，http：//lifecenter．sgst．cn/hit/）查詢成分已驗證的靶點[17]，通過 PubChem（https：//pubchem．ncbi．nlm．nih．gov/）查詢化合物的 SMILES[18]號，然后將SMILES號導(dǎo)入Swiss Target Prediction Database（http：//www．swisstargetprediction．ch/）預(yù) 測成分的靶點[19]。通過 Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www．uniprot．org/）[20]將所有成分的靶點校準(zhǔn)為官方基因名稱。

1.4 疾病靶點的查找 通過Therapeutic Targets Database（TTD，http：//bidd．nus．edu．sg/group/cjttd/）[21]，Drugbank database （https：//www．drugbank．ca/）[22]，及DisGeNET database （http：//www．disgenet．org/web/DisGeNET/menu/home）[23]查找肺癌相關(guān)靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一基因名稱。

1.5 成分靶點與疾病靶點共同靶點的獲取 通過Venny 2．1．0（http：//bioinfogp．cnb．csic．es/tools/venny/）[24]將成分靶點與疾病靶點取交集得到共同靶點，這些共同靶點認(rèn)為是當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌可能的關(guān)鍵靶點。

1.6 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 通過Cytoscape 3．2．1構(gòu)建成分-靶點等多層次網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的拓?fù)鋵W(xué)特征可以通過Cytoscape中的NetworkAnalyzer進(jìn)行計算，包括自由度、介數(shù)中心性及平均最短路徑長度等，其中度值是較為重要的評價指標(biāo)[25]。

1.7 基因富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david．ncifcrf．gov/）進(jìn)行通路富集分析，并通過Omicshare平臺 （http：//www．omicshare．com/tools/index．php/）對通路富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化處理[26]。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯中活性成分的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找到當(dāng)歸補(bǔ)血湯212個成分，其中黃芪87個，當(dāng)歸125個，經(jīng)過OB值和DL值篩選后，黃芪剩余19個成分，當(dāng)歸剩余2個成分。中藥中某些成分本身具有良好的生物活性，但因其口服生物利用度較低或不具有良好的類藥性等，在篩選時易被過濾掉，因此，本實驗在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[27-29]，黃芪中加入活性成分黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ及黃芪甲苷，共有23個成分納入后續(xù)研究，當(dāng)歸中加入活性成分阿魏酸及藁本內(nèi)酯，一共4個成分納入研究，見表1。

2.2 靶點的收集 通過HIT數(shù)據(jù)庫查找成分已通過實驗驗證的靶點，利用基于結(jié)構(gòu)相似性原理的Swiss Target Prediction Database來預(yù)測成分的靶點，黃芪中共得到398個靶點，當(dāng)歸中得到60個靶點，刪除重復(fù)項后，剩余194個靶點，其中有26個靶點為黃芪和當(dāng)歸所共有。通過TTD、Drugbank及DisGeNET數(shù)據(jù)庫查找肺癌相關(guān)靶點，其中TTD數(shù)據(jù)庫中查找到88個疾病靶點，Drugbank數(shù)據(jù)庫查找到135個，DisGeNET數(shù)據(jù)庫查找到70個靶點，刪除重復(fù)后剩余263個疾病相關(guān)靶點。通過Venny 2．1．0將成分靶點與疾病靶點取交集，得到45個共同靶點，這45個共同靶點視為當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌可能的潛在靶點，見圖2及表2。

2.3 活性成分-對應(yīng)靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 通過Cytoscape構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯中成分-對應(yīng)靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示，該網(wǎng)絡(luò)中包含了221個節(jié)點，458條邊，其中節(jié)點代表當(dāng)歸補(bǔ)血湯中成分或者成分對應(yīng)的靶點，邊表示成分和靶點之間具有相互作用，通過網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，存在多個成分對應(yīng)一個靶點或者一個成分對應(yīng)多個靶點的現(xiàn)象，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯是通過多成分、多靶點協(xié)同起效的方式輔助治療肺癌的。通過Cytoscape構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯中活性成分對應(yīng)45個共同靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4，網(wǎng)絡(luò)具有68個節(jié)點（45個為靶點節(jié)點，23個為成分節(jié)點），103條邊，利用Cytoscape中的NetworkAnalyzer分析節(jié)點的度值及相關(guān)參數(shù)，節(jié)點顏色由粉色變紅色表明度值逐漸增大，根據(jù)度值判斷靶點的重要性，由圖4可以看出，成分度值排名前3的為山奈酚（AR-15，度值 20）、槲皮素（AR-19，度值 8）、芒柄花素（AR-12，度值7），這些成分可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌比較重要的成分，靶點度值排名前3的為微管相關(guān)蛋白Tau（MAPT，度值12）、細(xì)胞色素P450 19A1（CYP19A1，度值10）、雌激素受體α（ESR1，度值8），當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過作用于這些靶點發(fā)揮輔助治療肺癌的作用。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯中的成分Tab.1 Com ponents in Danggui Buxue Decoction

2.4 通路富集分析及當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過DAVID平臺對45個靶點進(jìn)行基因的功能注釋及通路富集分析，結(jié)果表明45個靶點參與了170個生物過程相關(guān)的條目、30個細(xì)胞組成相關(guān)條目、54個分子功能相關(guān)條目，根據(jù)FDR＜0．05進(jìn)行篩選，生物過程篩選出16個條目，主要涉及跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、細(xì)胞增殖的正向調(diào)控等方面；細(xì)胞組成篩選出3個條目，涉及受體復(fù)合物、細(xì)胞器膜等方面；分子功能篩選出12個條目，主要涉及受體信號蛋白酪氨酸激酶活性、ATP結(jié)合等方面，見圖5。將DAVID通路富集分析結(jié)果 P值＜0．01的前 27條通路通過Omicshare平臺進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖6，圖中圓點越大，表明通路富集到的基因數(shù)目越多，圓點的顏色越紅，表明P值越小。對FDR＜0．05的8條通路通過Cytoscape構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯中中藥-活性成分-靶點-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖7所示，其中度值較高的通路為癌癥通路（pathwanys in cancer，度值 15）、癌癥蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer，度值 11）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B信號通路（PI3K-Akt signaling pathway，度值12）等，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過作用于這些通路來達(dá)到輔助治療肺癌的目的。

表2 當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的45個潛在靶點Tab.2 Forty-five potential targets of Danggui Buxue Decoction in adjuvant treatment of lung cancer

圖2 成分靶點與疾病靶點取交集后的韋恩圖Fig.2 Venn diagram after intersection of com ponent targets and disease targets

3 討論

當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪和當(dāng)歸兩味藥組成，是“補(bǔ)氣生血”的經(jīng)典方，可用于治療多種疾病，臨床上也用于肺癌化療時的輔助用藥[10]。由于中藥復(fù)方由多味中藥組成，每味中藥組成成分復(fù)雜，每個成分對應(yīng)靶點較多，靶點之間可能存在協(xié)同或拮抗等作用，因此難以闡明中藥復(fù)方治療某種疾病的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在研究者所建立的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行中藥成分、成分靶點、疾病靶點的查找，可以系統(tǒng)性、整體性的揭示靶點與疾病之間的相互關(guān)系，闡明中藥復(fù)方治療疾病的作用機(jī)制，這與中醫(yī)整體觀、辨證論治的思想不謀而合[12]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的作用機(jī)制，為臨床上當(dāng)歸補(bǔ)血湯的使用提供一定的理論指導(dǎo)。

圖3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯中成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)（紫色-黃芪成分，藍(lán)色-黃芪靶點，黃色-當(dāng)歸成分，綠色-當(dāng)歸靶點，紅色-黃芪當(dāng)歸共同靶點）Fig.3 Com pounds-targets interaction network of Danggui Buxue Decoction（Purple-Com pounds of Astragali Radix，Blue-Targetsof Astragali Radix，Yellow-Com pounds of Angelicae Sinensis Radix，Green-Targetsof Angelicae Sinensis Radix，Red-Common targets of Astragali Radix and Angelicae Sinensis Radix）

圖4 當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌活性成分-45個潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖（節(jié)點顏色由粉色變紅色表明自由度逐漸增大，菱形-活性成分，圓形-靶點）Fig.4 Network of active ingredients for ad juvant treatment of lung cancer in Danggui Buxue Decoction-45 potential targets（The changeof nodescolor from pink to red indicates that the degree of freedom increases gradually，Diamond-Active com ponent，Circular-Target）

圖5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

圖6 KEGG富集分析Fig.6 Enrichment analysisof KEGG

圖7 中藥-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)（綠色-中藥，紫色-活性成分，藍(lán)色-靶點，黃色-通路）Fig.7 Network of Traditional Chinese medicine-Com ponents-Targets-Pathways（Green-Traditional Chinese medicine，Purple-Active component，Blue-Target，Yellow-Pathway）

本研究分析了當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪和當(dāng)歸兩味中藥的活性成分，通過數(shù)據(jù)庫的查找、篩選及文獻(xiàn)的查閱，最終得到27個活性成分，其中23個屬于君藥黃芪，4個屬于臣藥當(dāng)歸。通過數(shù)據(jù)庫的查詢，黃芪中得到398個靶點，當(dāng)歸中得到60個靶點，刪除重復(fù)靶點后，剩余194個成分靶點，有26個靶點為黃芪和當(dāng)歸所共有。通過公共數(shù)據(jù)庫的查找，共查找到疾病相關(guān)靶點263個，將成分靶點與疾病靶點取交集后，得到45個共同靶點，這45個靶點視為當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌可能的關(guān)鍵靶點。通過構(gòu)建當(dāng)歸補(bǔ)血湯中活性成分-45個潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測出槲皮素、山奈酚、芒柄花素可能是當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的關(guān)鍵成分，已有研究表明槲皮素可以誘發(fā)BCL2/BAX介導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡壞死，并且通過擾動微管的有絲分裂，導(dǎo)致單極紡錘體的形成，造成細(xì)胞分裂的失敗，槲皮素還可以通過抑制波形蛋白和n-鈣黏蛋白的表達(dá)抑制A549細(xì)胞的遷移[30]；山奈酚可以抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的活力，降低cyclinD1的表達(dá)水平，用山奈酚處理A549細(xì)胞后，p-PI3K和p-Akt水平降低，表明山奈酚可以通過抑制PI3K-Akt信號通路的激活發(fā)揮抗腫瘤的作用[31]；芒柄花素可以改變細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、細(xì)胞周期蛋白A及細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)水平，誘導(dǎo)A549及NCI-H23兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[32]。槲皮素、山奈酚、芒柄花素均可在一定程度上抑制肺癌的發(fā)展，表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果具有一定的可靠性。黃芪多糖是黃芪的有效部位，現(xiàn)代大量研究表明黃芪多糖具有良好的調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的作用，因此可以用作治療肺癌時的輔助用藥[33]，如王永清[34]等發(fā)現(xiàn)黃芪多糖聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能、抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)及增加內(nèi)皮抑素（Endostatin）的表達(dá)是其可能的作用機(jī)制，但黃芪多糖本身是一種混合物，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要關(guān)注小分子化合物，因此在本研究中未涉及黃芪多糖。MAPT、CYP19A1、ESR1等是當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的主要靶點。MAPT與微管的聚合及解聚密切相關(guān)，并可以維持微管動力學(xué)的平衡[35]。MAPT與紫杉類藥物具有相同的結(jié)構(gòu)域，因此，當(dāng)MAPT高表達(dá)時，可以競爭性的與微管結(jié)合，這可能是采用紫杉類藥物對肺癌患者進(jìn)行化療時機(jī)體產(chǎn)生耐藥性的原因[36]，亦有研究通過miR-186靶向MAPT調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌對紫杉醇的化療敏感性[37]。CYP19A1又稱為芳香化酶或雌激素合成酶，可以將人體內(nèi)雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，是該過程的關(guān)鍵限速酶[38]，雌激素可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖，肺癌患者中雌激素水平往往高于正常人體，抗雌激素藥物對肺癌的發(fā)展具有抑制作用[39]，有研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者標(biāo)本中的CYP19A1蛋白含量明顯高于正常標(biāo)本[40]，亦有研究發(fā)現(xiàn)，CYP19A1基因的一個單核苷酸多態(tài)性基因分型rs3764221通過引起更高水平CYP19A1的表達(dá)而促進(jìn)肺腺癌的發(fā)展[41]。因此推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以作用于CYP19A1，從而減少雌激素的合成，抑制肺癌細(xì)胞增殖，達(dá)到輔助治療肺癌的作用。雌激素是類固醇激素，通過與靶器官上的雌激素受體結(jié)合而在體內(nèi)發(fā)揮作用。雌激素受體主要有兩個亞型，雌激素受體 α（ESR-α，ESR1）和雌激素受體 β（ESR-β，ESR2）[42]。Unai等[40]發(fā)現(xiàn) ESR1 在正常肺組織樣本中的表達(dá)要明顯高于非小細(xì)胞肺癌樣本，并且高表達(dá)ESR1的非小細(xì)胞肺癌患者生存率有所升高。現(xiàn)代研究表明，ESR1可以通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的水平促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，并且抑制細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)腫瘤的生長，ESR1也可以與EGFR相互作用激活PI3K-Akt信號通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖，該信號通路可以調(diào)節(jié)ESR1的活性，同樣ESR1對PI3K-Akt信號通路也具有調(diào)節(jié)作用[43]。有研究表明，PI3K-Akt通路可以參與免疫抑制微環(huán)境的形成，影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞的活性，而阻斷該通路可以恢復(fù)機(jī)體被破壞的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)自身免疫，從而增強(qiáng)抗腫瘤固有的免疫效應(yīng)[44]。肺癌患者在化療的同時，不僅殺死了癌細(xì)胞，人體的正常細(xì)胞也會受到損傷，使人體的免疫功能下降，中醫(yī)學(xué)中的“氣血陰陽虧虛”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中人體免疫功能低下關(guān)系密切，而當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以補(bǔ)氣生血[45]，因此推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能作用于ESR1，從而抑制PI3K-Akt信號通路的激活，通過增強(qiáng)自身的免疫能力達(dá)到輔助治療肺癌的目的，但該推測仍需要通過進(jìn)一步的實驗進(jìn)行驗證。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）與肺癌的發(fā)展關(guān)系密切[46]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過作用于CDK4及CDK2抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而起到輔助治療肺癌的作用。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移依賴于豐富的血液供應(yīng)，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在肺癌患者中高表達(dá)，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）水平在肺癌患者中亦有所升高，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[47]，因此推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能作用于VEGF及MMP抑制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，達(dá)到輔助治療肺癌的目的。以上研究均表明MAPT、CYP19A1、ESR1、CDK4、CDK2、VEGF、MMP 等基因與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的結(jié)果具有一定的可靠性。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，初步研究了當(dāng)歸補(bǔ)血湯中活性成分輔助治療肺癌的作用機(jī)制，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過多成分、多靶點、多通路的方式達(dá)到協(xié)同起效的目的，為后續(xù)進(jìn)一步研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯輔助治療肺癌的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為臨床上當(dāng)歸補(bǔ)血湯的合理應(yīng)用提供了理論依據(jù)。