牛華星 陳玲 楊修鎮(zhèn) 劉少寧 尹伶靈 章安源

高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)測定雞肝中慶大霉素殘留量

牛華星 陳玲 楊修鎮(zhèn) 劉少寧 尹伶靈 章安源

（山東省獸藥質量檢驗所 山東省畜產(chǎn)品質量安全檢測與風險評估重點實驗室 山東 濟南 250022）

應用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術(LC-MS/MS)，建立了雞肝中慶大霉素c組分的檢測方法。樣品經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，陽離子交換柱凈化，Poroshell HPH-C8(3.0×100mm，2.7μm)為分離色譜柱，以50mmol/L乙酸銨溶液(含2.0%氨水和0.2%甲酸)-乙腈為流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧離子源正離子檢測模式(ESI+)和多反應監(jiān)測(MRM)模式測定，外標法定量。結果表明，慶大霉素在進樣濃度在10~500ng/ml范圍內(nèi)線性關系良好(r2=0.9990)；方法檢出限和定量限分別為10μg/kg和25μg/kg；25、50、100、200μg/kg4個添加水平下，平均回收率在80%~100%之間，相對標準偏差RSD≤9.65%。本方法準確、簡單、快速。

液相色譜-串聯(lián)質譜 雞肝 慶大霉素 組分

慶大霉素[1]是由小單孢菌產(chǎn)生的抗生素，至少由4種主要成分(C1、C1a、C2、C2a組分)和幾種微量成分組成(Claes等, 1984; Thomas和Tappin, 1974)屬氨基糖苷類抗生素藥(aminoglycosides，AGs)[2]。由于價格低廉，被廣泛使用于食品動物，從而造成食品中的藥物殘留問題。為方便日常監(jiān)測，本文中采用液相色譜一串聯(lián)質譜法建立了雞肝中能同時測定慶大霉素4個組分的殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設備 Waters Xevo TQ-S高效液相-串聯(lián)質譜儀(配有電噴霧離子源)；CPA225D分析天平：感量0.01mg；PL602-S電子天平：感量0.01g；Milli-Q 超純水設備；水相針式濾器：孔徑0.22μm；Agilent PCX(60mg, 3ml)固相萃取柱。

1.1.2 標準品 慶大霉素(Gentamicin)：純度≥94%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，其中C1組分含量為31.0%，C1a組分含量為22.2%，C2與C2a組分含量為46.8%。

1.1.3 試劑 乙腈、甲酸、甲醇、氨水、乙酸、乙酸胺為色譜純；三氯乙酸、乙二胺四乙酸、磷酸二氫鉀為優(yōu)級純。超純水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.1.4 標準貯備液的配制 準確稱取慶大霉素標準品配制成1000μg/ml的標準貯備液，4℃避光保存，有效期為3個月。吸取標準儲備液適量，用0.3%乙酸溶液稀釋定容，得到慶大霉素濃度為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L的標準工作液，置4℃冰箱中避光保存。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 根據(jù)參考文獻[3]方法稱取試料2g±0.02g，于50ml離心管中，加10ml磷酸鹽緩沖液(稱取磷酸二氫鉀1.36g，用980ml水溶解，分別加入乙二胺四乙酸二鈉0.15g和三氯乙酸20g，溶解混勻并定容至1000ml，至4℃保存，有效期一個月)，渦漩混勻1min，超聲5min，以10000r/min離心10min。取上清液于另一50ml離心管中。殘渣再加磷酸鹽緩沖液10ml，重復提取一次，合并兩次提取液并定容至20ml，渦旋混勻，為備用液。依次用甲醇5ml和水5ml活化PCX陽離子交換柱，取10ml的備用液上柱，流干后，依次用水5m和甲醇5ml淋洗，抽干，用氨化甲醇5ml洗脫，收集洗脫液于10ml塑料離心管中，于40℃下用氮氣吹至近干，用0.3%醋酸水溶液溶解并定容至1ml，充分渦旋，用0.22μm濾膜過濾，上機待測。取空白樣品，同法處理，獲得試樣基質空白溶液?？瞻自囼灣患釉嚵贤?，采用完全相同的測定步驟進行平行操作。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱：Poroshell HPH-C8(3.0×100mm，2.7μm)；流動相：A為50mmol/L乙酸銨溶液(含2.0%氨水和0.2%甲酸)，B為乙腈；流速：0.4ml/min，進樣量：5μl。柱溫：35℃；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 質譜條件 根據(jù)參考文獻[4, 5]方法，電噴霧離子源，掃描方式：正離子掃描，檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)。毛細管電壓：2.5KV，離子源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：500℃，錐孔氣流速：50L/h，脫溶劑氣流速：1000L/h，倍增器電壓：650V，二級碰撞氣：氬氣。定性離子對、定量離子對、保留時間、錐孔電壓和碰撞能量參考值見表2。

表2 慶大霉素質譜檢測參數(shù)

注：帶*的離子對是定量離子對

1.2.4 基質匹配標準曲線的制備 精密量取相應慶大霉素標準工作液用空白基質溶液制得濃度為10、25、50、100、200、500ng/ml的系列基質匹配標準工作溶液，供高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質匹配標準曲線。求回歸方程和相關系數(shù)。

1.2.5 準確度和精密度 準確稱取空白試料樣品雞肝臟2±0.02g，準確加入適量標準工作液，使樣品中藥物的添加濃度為25μg/kg(定量限)、50μg/kg (1/2MRL)、100μg/kg(MRL)和200μg/kg(2MRL)，提取凈化處理后，經(jīng)高效液相色譜－串聯(lián)質譜儀測定，添加濃度各設置5個平行，重復3批。

1.2.6 測定方法 取試樣溶液和相應的基質匹配標準溶液，作單點校準，外標法計算。基質匹配標準溶液及試樣溶液中各藥物的峰面積均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。

表3 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍 (%)

2 結果

2.1 線性考察

以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標準溶液濃度(μg/ml)為橫坐標，繪制標準曲線(表4)。慶大霉素藥物在濃度為10μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L系列基質添加濃度標準溶液進行分析檢測，得到線性回歸方程見表4，在10~500 ng/ml的濃度范圍內(nèi)，該藥物的定量離子峰面積與濃度均呈良好線性關系，相關系數(shù)均大于0.990。

表4 各可食性組織中慶大霉素標準曲線回歸方程和相關指數(shù)

表5 雞肝臟中慶大霉素的添加回收率、批內(nèi)和批間精密度 (ng/ml、%)

2.2 檢測限和定量限

雞肝中添加濃度為25μg/kg時，慶大霉素峰面積響應值和信噪比滿足定量限的要求信噪比(S/N)≥10，因此確定方法的定量限為25μg/kg。添加濃度為10μg/kg時，慶大霉素峰面積響應值和信噪比滿足定量限的要求信噪比(S/N)≥3，因此確定方法的檢測限為10μg/kg。

2.3 回收率及重復性試驗

雞肝中添加慶大霉素，液質分離良好，無干擾，添加濃度25μg/kg(定量限)、50μg/kg(1/2 MRL)、100μg/kg(MRL)和200μg/kg(2MRL)，添加濃度各設置5個平行，重復3批。批內(nèi)批間變異系數(shù)均小于10%，陽性添加樣品的回收率在80%~ 100%(表5)批內(nèi)批間相對標準偏差均小于9%。

3 討論與小結

（1）由于液相色譜－串聯(lián)質譜存在基質效應，而且基質中某些干擾組分的存在會使待測組分離子生成的速度與標準品相比有顯著不同，因此本試驗對品基質效應進行研究：用空白樣品制作空白基質吹干后，加入一定量標準溶液，制成基質標準溶液；在空白樣品中加入一定量標準溶液，制成基質匹配標準溶液；與相應濃度的純標準溶液比較，發(fā)現(xiàn)基質效應明顯，因此定量時采用基質匹配標準曲線。（2）方法前處理簡單，回收率和精密度能滿足分析要求，符合我國《獸藥殘留技術規(guī)范》[6]的要求，能快速準確檢測雞肝中的慶大霉素殘留。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部)[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2015. 1324-1326.

[2] 侯亞麗, 蘇亮, 丁平等. 慶大霉素的殘留檢測方法慶大霉素殘留[J]. 中國飼料, 2007(12): 28.

[3]田強兵, 巨歡等. 高效液相色譜-質譜法測定魚肉中慶大霉素主要組分C1、C1a、C2[J]. 理化檢驗(化學分冊). 2019, 55(1).

[4] 劉雪紅, 張秀琴, 侯穎等. 超高效液相-串聯(lián)質譜法檢測牛奶中7種氨基糖苷類殘留[J]. 中國獸藥雜志, 2015, 49(3): 48-52.

[5]趙靜, 劉婷, 蔡柏巖等. HPLC法測定原料乳中慶大霉素殘留的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2015, 36(9): 95-97.

[6]農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2003]1號. 關于發(fā)布《獸藥殘留試驗技術規(guī)范(試行)》的通知[Z]. 2003.

（2019–08–05）

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