姜曉潔 姜曉

CRISPR/Cas9的發(fā)展及在基因組編輯中的應(yīng)用

姜曉潔①姜曉②*

（①山東省海陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 265100 ②山東省海陽(yáng)市留格莊鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站）

CRISPR/Cas9系統(tǒng)為研究基因的功能和疾病的發(fā)生提供了一種簡(jiǎn)單有效的基因操作工具。CRISPR/Cas9由一個(gè)非特異性的Cas9核酸酶和一組可編輯的序列特異性CRISPR-RNA(crRNA)組成，而crRNA能夠指導(dǎo)Cas9蛋白在靶位點(diǎn)使DNA產(chǎn)生雙鍵斷裂從而線性化DNA。隨后胞內(nèi)的DNA修復(fù)過(guò)程導(dǎo)致了靶向位點(diǎn)DNA的插入，刪除和替代。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA線性化的特異性受到crRNA序列配對(duì)和靶向位點(diǎn)上游PAM區(qū)的影響。本文將介紹CRISPR/Cas9在基因組編輯中的機(jī)制及未來(lái)在基因編輯和臨床治療中的應(yīng)用。

DNA的重組和操作技術(shù)在過(guò)去的60年有了重大的發(fā)展。這個(gè)發(fā)展開(kāi)始于DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)，隨后DNA的化學(xué)合成及檢測(cè)技術(shù)為研究基因功能建立了基礎(chǔ)。酶切和PCR技術(shù)的發(fā)展為基因的擴(kuò)增及其在體外，細(xì)胞和模式動(dòng)物的突變提供了一種可行的方法。隨后，基因組測(cè)序技術(shù)及產(chǎn)生的不同物種的整個(gè)的基因組數(shù)據(jù)在過(guò)去20年有了長(zhǎng)足的發(fā)展。近幾年，起源于細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)的CRISPR/Cas9技術(shù)為轉(zhuǎn)化生物學(xué)提供了穩(wěn)定的基因組編輯技術(shù)。

1 基因組編輯技術(shù)的發(fā)展

自從DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)之后，研究者便致力于研究細(xì)胞和微生物中基因堿基位點(diǎn)的特異性突變[1]。許多基因組編輯技術(shù)的早期方法主要依賴于基因組序列位點(diǎn)特異性的識(shí)別方法。細(xì)菌和酵母的天然的DNA修復(fù)和重組途徑揭示了細(xì)胞中DNA雙鍵斷裂后自我修復(fù)的分子機(jī)制。因此，細(xì)胞中DNA的斷裂為基因組的打靶提供了一種可行的方案[2-5]。早期的DNA靶向線性化的方法主要依賴于寡聚核苷酸和小分子對(duì)DNA堿基對(duì)的修復(fù)識(shí)別。隨后，基因組編輯中內(nèi)含子的自我剪切為位點(diǎn)特異性的DNA線性化和整合提供了一種新的思路[6, 7]。大約在同一時(shí)間，ZFNs(Znic-Finger Nulcease,鋅指核酸酶)介導(dǎo)了模式化的DNA識(shí)別蛋白產(chǎn)生，當(dāng)這個(gè)蛋白與限制性內(nèi)切酶Fok I識(shí)別的特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合時(shí)，在特異性的位點(diǎn)能夠造成DNA序列的有效斷裂，而ZFNs技術(shù)在果蠅和哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體中的識(shí)別被證明是有效的[8-9]。盡管ZFNs技術(shù)對(duì)某些實(shí)驗(yàn)中的基因編輯技術(shù)是完全有效的，但其在任意位點(diǎn)設(shè)計(jì)和證明的難度決定了其不能廣泛地應(yīng)用于物種的基因組編輯中。隨后，與ZFNs原理類似的TALENs (Transcri-ption activator–like effectors)技術(shù)的應(yīng)用能夠耦合Fok I內(nèi)切酶從而造成DNA特異性位點(diǎn)的斷裂[10-12]。相對(duì)于ZFNs技術(shù)，TALENs在基因組編輯中更靈活和有效，但是蛋白設(shè)計(jì)合成的難度仍然是制約其發(fā)展的一個(gè)重要原因。

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)展

（1）CRISPRs系統(tǒng)首先在大腸桿菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，隨后在多數(shù)的細(xì)菌和古生菌中被發(fā)現(xiàn)并預(yù)言了其在DNA修復(fù)和調(diào)控中的可能機(jī)制[13-14]。在2005年一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)證明CRISPRs的基因間隔序列都從病毒的質(zhì)粒分化而來(lái)，同時(shí)明確了編碼核酸酶和解旋酶相關(guān)的Cas基因蛋白[15]。2007年，噬菌體感染乳酸嗜熱鏈球菌的實(shí)驗(yàn)證明了CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的獲得性免疫，這個(gè)發(fā)現(xiàn)也證明了CRISPR/Cas存在于牛奶生產(chǎn)工藝中的細(xì)菌中，而這些細(xì)菌的存在能夠有效地控制噬菌體帶來(lái)的污染[16]。2008年，成熟的CRISPR RNAs能夠作為Cas蛋白的向?qū)Ц蓴_影響大腸桿菌的病毒的分化。同時(shí)，在表皮葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR/ Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA靶向剪切活性[17-18]。（2）功能性的CRISPR是由CRISPR陣列重復(fù)，DNA靶向序列間隔以及編碼crRNA組分和Cas蛋白操縱子的組分構(gòu)成[19]。自然環(huán)境下，病毒能夠通過(guò)CRISPR間隔序列與細(xì)菌發(fā)生匹配，而病毒能夠在CRISPR介導(dǎo)的毒力減弱過(guò)程中不斷發(fā)生變化。獲得性免疫的發(fā)生由三個(gè)階段組成[20]：第一個(gè)階段是病毒的DNA短序列作為CRISPR系統(tǒng)的基因間隔序列插入；第二個(gè)階段是crRNA前體的產(chǎn)生和成熟并最終產(chǎn)生個(gè)體識(shí)別的crRNAs；而第三個(gè)階段則是Cas蛋白和tracrRNA或crRNA介導(dǎo)的外源核酸序列的線性化。在整個(gè)的過(guò)程中，三種CRISPR/Cas系統(tǒng)均能夠使外源DNA的產(chǎn)生線性化[21-22]。在這三種CRISPRs系統(tǒng)中，I型的和III型的都利用一個(gè)大的Cas蛋白對(duì)crRNA進(jìn)行靶向的剪切，而II型的CRISPR系統(tǒng)則僅僅利用一個(gè)單獨(dú)的Cas蛋白進(jìn)行RNA介導(dǎo)的DNA識(shí)別和線性化[23, 24]，這對(duì)于基因組的編輯應(yīng)用具有重要的意義。

3 CRISPR/Cas 9的功能

（1）Cas9的生物信息學(xué)分析表明其擁有兩個(gè)潛在的酶切結(jié)構(gòu)域，分別是HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域[25]，前期的研究表明嗜熱鏈球菌的Cas9對(duì)于抵御病毒的入侵有重要的作用，其作用的機(jī)理可能是介導(dǎo)了入侵的質(zhì)粒和噬菌體基因組的雙鍵斷裂(DSBs)[26]。而在此過(guò)程中，HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域能夠影響外源質(zhì)粒的降解效率。（2）而與序列特異性相關(guān)的成熟的crRNA則受到II型的CRISPR/Cas9蛋白上游tracrRNA(轉(zhuǎn)錄激活crRNA)調(diào)控。成熟的crRNA對(duì)于RNA介導(dǎo)的靶向位點(diǎn)DNA的內(nèi)切有重要的作用。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域能夠與crRNA中的20個(gè)核苷酸互補(bǔ)從而使序列線性化。而RuvC結(jié)構(gòu)域則能夠線性化DNA的另一條互補(bǔ)鏈[23]。HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)突變會(huì)造成單鏈DNA單鏈的斷裂活性，然而HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域的同時(shí)突變會(huì)形成RNA介導(dǎo)的DNA連接蛋白。外源DNA的識(shí)別需要靶序列上游與crRNA的配對(duì)的短序列和毗鄰靶序列的PAM同時(shí)存在[23, 24]圖1)。（3）實(shí)際應(yīng)用中，crRNA被編輯成具有先導(dǎo)作用的sgRNA。而sgRNA保留了兩個(gè)重要的特征，其5’端的20bp核苷酸序列決定了DNA的識(shí)別位點(diǎn)，而與其互補(bǔ)的3’序列能夠與Cas9結(jié)合。sgRNA的這個(gè)簡(jiǎn)單的雙分系統(tǒng)能夠利用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯任何毗鄰PAM的序列[23]。與ZNFs系統(tǒng)和TALENs系統(tǒng)不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)DNA的編輯僅僅是需要sgRNA的改變?；诖嗽?，CRISPR系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組的打靶、編輯和修飾過(guò)程中。

圖1：CRISPR/Cas9 II型系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能

A.CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和操縱單元 B.CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的主動(dòng)防御及外源DNA的斷裂和降解 C：TracrRNA和crRNA介導(dǎo)的DNA線性化過(guò)程[1]

4 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組打靶的機(jī)制

（1）分子結(jié)構(gòu)觀察表明Cas9通過(guò)先導(dǎo)RNA與靶向DNA結(jié)合時(shí)，其分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生重排變化。這種變化會(huì)使Cas9蛋白完全包裹RNA-DNA的結(jié)合位點(diǎn)。而Cas9蛋白的兩翼則被富含精氨酸的α螺旋所橋接，而這種結(jié)構(gòu)對(duì)于RNA介導(dǎo)的DNA突變位點(diǎn)的識(shí)別有重要的意義[27, 28]。因此，Cas9分子構(gòu)象的改變可能是RNA靶向定位DNA分子的一個(gè)重要原因。而PAM的存在對(duì)于DNA的識(shí)別同樣有重要的意義，缺少了PAM結(jié)構(gòu)域，即使先導(dǎo)RNA序列能夠和靶序列完全匹配，Cas9蛋白也不能識(shí)別。Cas9蛋白與先導(dǎo)鏈RNA和靶點(diǎn)DNA形成的晶體結(jié)構(gòu)證明PAM位于堿基配對(duì)的DNA結(jié)構(gòu)內(nèi)[29]。Cas9蛋白C末端的精氨酸模體結(jié)構(gòu)域與非互補(bǔ)鏈的PAM結(jié)構(gòu)域均位于Cas9兩個(gè)基團(tuán)形成的大溝內(nèi)。而靶向DNA的磷酸二酯與位于小溝內(nèi)的PAM相互作用導(dǎo)致位于PAM上游的靶向DNA鏈的形成解鏈結(jié)構(gòu)(R-loop)[30]。單分子的實(shí)驗(yàn)證明R-loop的結(jié)合速度主要受PAM的影響，而其穩(wěn)定性則主要由PAM上游的間隔序列決定。綜上，靶向DNA的解鏈開(kāi)始于PAM的識(shí)別，最終導(dǎo)致R-loop結(jié)構(gòu)的形成，伴隨著RNA的侵入最終形成RNA-DNA的雜交結(jié)構(gòu)(圖2)。（2）為評(píng)估CRISPR /Cas9在細(xì)胞中與靶位點(diǎn)的結(jié)合能力，研究者用高通量測(cè)序和免疫共沉積技術(shù)確定了Cas9在基因組中連接位點(diǎn)的數(shù)量和類型。結(jié)果表明在人和小鼠的細(xì)胞中，Cas9能夠與基因組上與sgRNA配對(duì)的許多非激活位點(diǎn)結(jié)合[31, 32]。而Cas9與這些脫靶位點(diǎn)的結(jié)合主要受到PAM結(jié)構(gòu)域和配對(duì)的先導(dǎo)鏈RNA序列的影響。激活的Cas9不能線性化脫靶位點(diǎn)的DNA序列表明了其活性與靶位點(diǎn)DNA的結(jié)合能力，序列配對(duì)有重要的聯(lián)系。另外，相對(duì)于緊縮的染色體結(jié)構(gòu)，Cas9蛋白與開(kāi)放的染色體的結(jié)合能力更強(qiáng)(圖2)。

圖2 Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[37]。tracrRNA和sgRNA介導(dǎo)的Cas9蛋白對(duì)DNA靶位點(diǎn)的識(shí)別

5 Cas9蛋白靶向識(shí)別的忠實(shí)性

Cas9酶能夠通過(guò)RuvC和HNH的酶切結(jié)構(gòu)域?qū)邢駾NA切成平末端的雙鍵斷裂(DSB)的DNA。Cas9蛋白能夠通過(guò)RuvC和HNH酶切結(jié)構(gòu)域的點(diǎn)突變使DNA產(chǎn)生單鏈的斷裂(SSB)。而單鏈DNA的非同源末端修復(fù)(NHEJ)相對(duì)于基因重組修復(fù)(HR)有更高的忠誠(chéng)性。為了提高DSB修復(fù)的忠誠(chéng)性，一種類似于ZNFs和TALENs高忠誠(chéng)性修復(fù)的方法被發(fā)現(xiàn)[33, 34]，應(yīng)用成對(duì)的sgRNAs和Cas9 (HNH+/RuvC-結(jié)構(gòu)域)突變體(D10A)能夠有效的提高DNA雙鏈中的插入缺失效率，這種方法能夠產(chǎn)生具有粘性末端的雙鍵斷裂，當(dāng)外源同源臂和目的基因存在時(shí)，基因的同源重組修復(fù)能夠使目的基因有效的插入到突變點(diǎn)。而這種DNA雙鍵斷裂的方案在sgRNA過(guò)短或者存在錯(cuò)配過(guò)多，其脫靶性顯著的增加[35]。而sgRNA的合適設(shè)計(jì)和Cas9的合理使用會(huì)顯著的提高其忠實(shí)性。

6 CRISPR/Cas9在細(xì)胞編輯中的應(yīng)用

（1）從CRISPR系統(tǒng)被證明能夠有效的編輯人類細(xì)胞開(kāi)始，經(jīng)過(guò)人工改造的Cas9蛋白和人類設(shè)計(jì)的sgRNAs以及tracrRNA被證明能在人的胚胎干細(xì)胞，小鼠的細(xì)胞中共表達(dá)。在靶向的位點(diǎn)產(chǎn)生了靶向的DNA雙鍵斷裂(DSBs)，從而激活了RNA介導(dǎo)的DNA非同源末端的基因修復(fù)和基因的替換。同時(shí)多重的基因打靶也被證明具有可行性。這項(xiàng)技術(shù)與TALENs和ZNFs技術(shù)相比，其基因編輯的效率能達(dá)到80%[36-38]。（2）迄今為止，Cas9蛋白已經(jīng)廣泛的有效的應(yīng)用于多個(gè)物種和細(xì)胞系的基因編輯中，這些物種包括人類的細(xì)胞系，細(xì)菌，酵母，斑馬魚，小鼠，豬和猴子[39, 40]。同時(shí)，Cas9也能引起同一物種的不同基因的突變。Cas9能夠與crRNA和tracr RNA，sgRNAs配對(duì)到靶位點(diǎn)，而影響Cas9活性的主要因素則是位于靶位點(diǎn)下游的PAM區(qū)。與早期的Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用所不同的是，sgRNA上游增加48bp長(zhǎng)度的tracrRNA會(huì)形成更高水平的NHEJ(非同源末端連接)。增加的tracrRNA對(duì)于sgRNA的穩(wěn)定性以及Cas9-sgRNA-DNA的末端復(fù)合物的形成具有重要作用。這種設(shè)計(jì)表明sgRNA的結(jié)構(gòu)對(duì)于Cas9的活性起重要的作用[41-43]。（3）CRISPR/Cas系統(tǒng)的共性是通過(guò)改變不同的pre-crRNA，其能同時(shí)線性化許多共同的靶位點(diǎn)，利用其這個(gè)特點(diǎn)能夠有效的同時(shí)干擾多個(gè)基因的表達(dá)。事實(shí)上，Cas9基因和多重的sgRNA的共表達(dá)能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成有效的基因編輯。

7 Cas9在細(xì)胞和動(dòng)物模型建立中的應(yīng)用

（1）Cas9蛋白現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同物種的靶向基因編輯中，而Cas9的靶向定位能夠大規(guī)模實(shí)現(xiàn)基因組的干擾從而有利于檢測(cè)基因的功能或者闡明基因的可變剪切。另外，野生型的Cas9能夠通過(guò)抑制催化結(jié)構(gòu)域的激活從而轉(zhuǎn)變成RNA介導(dǎo)的生物學(xué)工具。而Cas9與調(diào)控元件模塊的融合則能夠提高Cas9在基因編輯中的效率[37]。（2）Cas9介導(dǎo)的加速了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和動(dòng)物模型的建立。通過(guò)患病體細(xì)胞的基因突變，CRISPR/ Cas9能夠快速的建立疾病的細(xì)胞模型，同時(shí)能夠利用ES和IPS細(xì)胞疾病模型實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立[37]。（3）在細(xì)胞模型的建立中，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染攜帶有sgRNA質(zhì)粒和Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)的基因打靶模型的建立。此外，Cas9的多重功能能夠?yàn)槿祟惖钠胀膊√峁┛尚械慕鉀Q方案。大規(guī)模的基因組分析能夠評(píng)估疾病帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，然而，疾病是由哪種可變剪切引起無(wú)法預(yù)料，利用Cas9蛋白則能夠探測(cè)出可變剪切對(duì)基因功能的影響[38]。（4）在動(dòng)物模型的建立中，編輯好的sgRNA和Cas9 可以通過(guò)原核注射的方法注入到受精卵中實(shí)現(xiàn)遺傳基因的修飾。這種方法減少了利用體細(xì)胞核移植技術(shù)制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的時(shí)間和成本。而獼猴模型的多基因的打靶動(dòng)物的出生表明了人類疾病可以通過(guò)靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立模型。另外，Cas9在體細(xì)胞中的直接應(yīng)用避免了胚胎的操作同時(shí)為生物治療的建立提供原材料。然而在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和原核注射技術(shù)建立轉(zhuǎn)基因嵌合體動(dòng)物模型的過(guò)程中仍然存在效率較低的問(wèn)題。因?yàn)樵谑芫言缙?，胚胎中基因的表達(dá)和活性直到第一次有絲分裂開(kāi)始才被激活。而NHEJ介導(dǎo)的基因修復(fù)能夠引入隨機(jī)長(zhǎng)度DNA的插入突變，這種轉(zhuǎn)錄的延遲可能在CRISPR修飾的嵌合體小鼠生產(chǎn)過(guò)程中降低其效率[37, 38, 43]。

9 結(jié)論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為基因的編輯技術(shù)提供了一種可行的方案，同時(shí)這項(xiàng)技術(shù)也為研究基因的功能和基因缺陷性疾病提供了簡(jiǎn)單有效的工具。而未來(lái)的研究對(duì)于提高CRISPR/Cas9的忠實(shí)性，降低其脫靶效率有重要的意義。而最新的基因組測(cè)序技術(shù)將有助于提高sgRNA的靶位點(diǎn)的特異性。

[1] Doudna J A, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with Crispr/Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): 1258096.

[2] Rong Y S, Golic K G. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila[J]. science, 2000, 288(5473): 2013-2018.

[3] Plessis A, Perrin A, Haber J E, et al. Site-specific recombination determined by I-SceI, a mitochondrial group I intron-encoded endonuclease expressed in the yeast nucleus[J]. Genetics, 1992, 130(3): 451-460.

[4] Rouet P, Smih F, Jasin M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease[J]. Molecular and cellular biology, 1994, 14(12): 8096-8106.

[5] Choulik A, Perrin A, Dujon B, et al. Induction of homologous recombination in mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae[J]. Molecular and cellular biology, 1995, 15(4): 1968-1973.

[6] Strobel S A, Dooucette-stamml A, Ribe L, et al. Site-specific cleavage of human chromosome 4 mediated by triple-helix formation[J]. Science, 1991, 254(5038): 1639-1642.a

[7] Faruoi A F, Egholm M, Glazer P M. Peptide nucleic acid-targeted mutagenesis of a chromosomal gene in mouse cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95(4): 1398-1403.

[8] Bibilova M, Beumer K, Trautman J K, et al. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases[J]. Science, 2003, 300(5620): 764-764.

[9] Bibilova M, Golic M, Golic K G, et al. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J]. Genetics, 2002, 161(3): 1169-1175.

[10] Baoch J, Scholze H, Schornack S, et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[J]. Science, 2009, 326(5959): 1509-1512.

[11] Moscou M J, Bogdanove A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors[J]. Science, 2009, 326(5959): 1501-1501.

[12] Christian M, Cermak T, Doyle E L, et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J]. Genetics, 2010, 186(2): 757-761.

[13] Makarova K S, Aravind L, Grishin N V, et al. A DNA repair system specific for thermophilic Archaea and bacteria predicted by genomic context analysis[J]. Nucleic acids research, 2002, 30(2): 482-496.

[14] Guy C P, Majernik A I, Chong J P J, et al. A novel nuclease-ATPase (Nar71) from archaea is part of a proposed thermophilic DNA repair system[J]. Nucleic acids research, 2004, 32(21): 6176-6186.

[15] Haft D H, Selengut J, Mongodin E F, et al. A guild of 45 Crispr-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes[J]. PLoS Comput Biol, 2005, 1(6): e60.

[16] Barrangou R, Horvath P. Crispr: new horizons in phage resistance and strain identification[J]. Annual review of food science and technology, 2012, 3: 143-162.

[17] Brouns S J J, Jore M M, Lundgren M, et al. Small Crispr RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]. Science, 2008, 321(5891): 960-964.

[18] Marraffini L A, Sontheimer E J. Crispr interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J]. science, 2008, 322(5909): 1843-1845.

[19] Sun C L, Barrangou R, Thomas B C, et al. Phage mutations in response to Crispr diversification in a bacterial population[J]. Environmental microbiology, 2013, 15(2): 463-470.

[20] Barrangou R, Marraffini L A. Crispr/Cas systems: prokaryotes upgrade to adaptive immunity[J]. Molecular cell, 2014, 54(2): 234-244.

[21] Baondy-denomy J, Davidson A R. To acquire or resist: the complex biological effects of CRISPR–Cas systems[J]. Trends in microbiology, 2014, 22(4): 218-225.

[22] Makarova K S, Aravind L, Wolf Y I, et al. Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of Crispr/Cas systems[J]. Biol Direct, 2011, 6(1): 38.

[23] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science, 2012, 337(6096): 816-821.

[24] Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, et al. Cas9–crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(39): E2579-E2586.

[25] Makarovs K S, Grishin N V, Shabalina S A, et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action[J]. Biology direct, 2006, 1(1): 7.

[26] Deltcheva E, Chylinski K, Sharma C M, et al. Crispr RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J]. Nature, 2011, 471(7340): 602-607.

[27] Jinek M, Jiang F, Taylor D W, et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation[J]. Science, 2014, 343(6176): 1247997.

[28] Nishimasu H, Ran F A, Hsu P D, et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J]. Cell, 2014, 156(5): 935-949.

[29] Anders C, N aiewoehner O, Duerst A, et al. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease[J]. Nature, 2014, 513(7519): 569-573.

[30] Szczelkun M D, Tikhomirovs M S, Sinkunas T, et al. Direct observation of R-loop formation by single RNA-guided Cas9 and Cascade effector complexes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014, 111(27): 9798-9803.

[31] Kuscu C, Arslan S, Singe R, et al. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(7): 677-683.

[32]Wux, Scott D A, Kriz A J, et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(7): 670-676.

[33] Mali P, Aach J, Stranges P B, et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering[J]. Nature biotechnology, 2013, 31(9): 833-838.

[34] Ran F A, Hsu P D, Lin C Y, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity[J]. Cell, 2013, 154(6): 1380-1389.

[35] Fu Y, Sander J D, Reyon D, et al. Improving Crispr/Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(3): 279-284.

[36] Mail P, Esvelt K M, Church G M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology[J]. Nature methods, 2013, 10(10): 957-963.

[37] Hsu P D, Lander E S, Zhang F. Development and applications of CRISPR/Cas9 for genome engineering[J]. Cell, 2014, 157(6): 1262-1278.

[38] Sander J D, Joung J K. Crispr/Cas systems for editing, regulating and targeting genomes[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(4): 347-355.

[39] Gratz S J, Cummings A M, Nguyen J N, et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease[J]. Genetics, 2013, 194(4): 1029-1035.

[40] Chang N, Sun C, Gao L, et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos[J]. Cell research, 2013, 23(4): 465-472.

[41] Wang H, Yang H, Shivalila C S, et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell, 2013, 153(4): 910-918.

[42] Cheng A W, Wang H, Yang H, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system[J]. Cell research, 2013, 23(10): 1163-1171.

[43] Niu Y, Shen B, Cui Y, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos[J]. Cell, 2014, 156(4): 836-843.

（2019–09–30）

S818.9

A

1007-1733(2019)10-0077-04