婁安鋼 楊詠潔 金太花 張睿 崔成都 于龍政 關(guān)立增

延邊黃牛和韓延牛血液外胞體中miRNA的差異表達(dá)分析

婁安鋼①楊詠潔①金太花②張睿①崔成都①于龍政①關(guān)立增①②*

（①延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 吉林延吉 133002 ②臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院 山東臨沂）

為進(jìn)一步探討Exosome中miRNA對(duì)延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)控差異。本研究從延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中分離出miRNA，通過RNASEQ測(cè)序和生物信息學(xué)技術(shù)分析了延邊黃牛及韓延牛血液Exosome中miRNA的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果表明，在延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中獲得差異表達(dá)miRNA有524個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的271個(gè)，下調(diào)表達(dá)的253個(gè)，其中已知miRNA 382個(gè)，新miRNA 142個(gè)；差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果說明，在兩個(gè)品種牛中共預(yù)測(cè)到 52348個(gè)靶基因。GO富集分析可知，這些靶基因被富集到3473條生物學(xué)過程，394條細(xì)胞組分以及879條分子功能。KEGG分析可知，這些預(yù)測(cè)得到的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號(hào)通路中，其中最顯著富集的通路為mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路。其中顯著差異表達(dá)的miR-9-5p和miR-99b調(diào)控的一些靶基因都與mTOR信號(hào)通路有密切的關(guān)系。結(jié)論：血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育差異的過程中可能發(fā)揮重要的作用。將為下一步在分子水平上探討關(guān)鍵差異表miRNA影響邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育差異的分子機(jī)制提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

延邊黃牛 韓延牛 外胞體 miRNA

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼的小分子RNA，其可通過靶向降解mRNA 或抑制蛋白的翻譯而發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA調(diào)控著哺乳動(dòng)物約60%的基因，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)形成、腫瘤發(fā)生、發(fā)展等一系列生物學(xué)過程[2]。因此，miRNA是生物體內(nèi)一類重要的基因調(diào)控因子，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[3]。

外胞體(Exosome)是由細(xì)胞分泌的40~200nm的小囊泡[4]。Exosome在不同的生理病理過程中發(fā)揮著不同的作用，具有細(xì)胞間信息交流及物質(zhì)傳遞的功能，可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在所有體液中都有Exosome的存在(唾液、母乳、血液、滑液、羊水、尿液、精子和卵泡液等)，通過這些體液Exosome可到達(dá)靶細(xì)胞，發(fā)揮不同的功能[5]。自從2007年Valadi等發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞來源的Exosome含有miRNA，并指出Exosome介導(dǎo)的miRNA轉(zhuǎn)移是各類細(xì)胞之間交換遺傳信息的一種機(jī)制后，關(guān)于Exosome-miRNA的研究開始不斷涌現(xiàn)[6]。研究表明，Exosome中含有大量的miRNA，如Melnik等從牛乳Exosome中發(fā)現(xiàn)了miR21、miR29a、miR-29b、miR-155、miR-103及miR-7a、b、c、f等，并證明與代謝有關(guān)系[7]。Chen等利用Solexa測(cè)序分析技術(shù)從豬乳Exosome中檢測(cè)到491種miRNA，并由生物信息學(xué)分析可知，這些 miRNA中的一些參與生物過程，例如轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化和增殖，免疫和代謝[8]。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于Exosome中miRNA的研究主要集中在人與動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)作用方面，關(guān)于其在動(dòng)物中的其它生物學(xué)功能的報(bào)道則較少。而最近的資料證明，Exosome中miRNA對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)調(diào)控方面發(fā)揮作用，如Melnik等研究發(fā)現(xiàn)牛乳Exosome中的miRNA-21可以促進(jìn)犢牛的生長(zhǎng)發(fā)育[7]。陳婷等用來源于豬Exosome的miR-PC-86和miR-PC-263處理C2C12細(xì)胞，結(jié)果顯示二者可調(diào)控C2C12 細(xì)胞上IGF-1R受體的表達(dá)，從而對(duì)豬肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)揮調(diào)控的作用[9]。由此表明，Exosome中的一些miRNA 可能與動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育有著密切的關(guān)系?；谇叭说难芯炕A(chǔ)，本試驗(yàn)旨在以延邊黃牛和韓延牛為研究對(duì)象，通過RNA-Seq技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，進(jìn)而為進(jìn)一步深入研究miRNA對(duì)延邊黃牛生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 延邊黃牛和韓延牛血液樣品 由吉林省龍井市某牛場(chǎng)提供，隨機(jī)選擇延邊黃牛和韓延牛各5頭，采取血液。

1.2 主要試劑和設(shè)備 DEPC、Trizol購(gòu)自華美生物工程公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；RNA提取試劑盒(Exosome DNA Extraction Kits)購(gòu)自美國(guó)Illu-mina公司。MDF-U4u863 -80℃冰箱購(gòu)自日本SAN YO公司；MCO-18AIC三洋二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋有限公司；梯度PCR儀購(gòu)自Eppendorf公司；核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 延邊黃牛和韓延牛血液Exosome的提取 通過頸靜脈采血方法分別對(duì)5頭延邊黃牛和5頭韓延牛采取血液后放入50ml離心管中，以3000rpm離心10min，獲得血清，然后將5頭延邊黃牛和5頭韓延牛血清樣品分別混在一起獲得延邊黃牛血清混合樣和韓延牛血清混合樣。之后分別取兩個(gè)品種牛的血清混合樣以5000rpm離心10min，取上清，以10000rpm離心30min；取上清放入超高速離心機(jī)中，以60000rpm離心3h；棄上清，用0.01 M PBS反復(fù)將沉淀吹下，用移液器將懸液吸入EP管中，再使用移液器反復(fù)吹打使其溶解，最后將懸液于超速離心管中，放入超高速離心機(jī)中，以60000rpm離心2h；棄上清，吸入離心管中，加入0.01 M PBS溶液，用移液器將沉淀反復(fù)吹打，使其完全混勻即為Exosome溶液。

1.4 延邊黃牛和韓延牛血液Exosome RNA的提取 血清Exosome中的RNA提取主要按Exosome DNA Extraction Kits試劑盒(美國(guó)Illumina公司)步驟進(jìn)行。

1.5 小RNA（sRNA）的高通量測(cè)序 將上述獲得小RNA樣品使用PAGE膠分離18~50nt之間的條帶，純化回收小RNA。使用T4 RNA連接酶將獲得的片斷兩端分別與3′和5′接頭連接，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后PCR擴(kuò)增，獲得cDNA文庫(kù)。將構(gòu)建好的文庫(kù)使用Agilent2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢測(cè)。最后將獲得的cDNA文庫(kù)送往深圳華大基因組公司，通過該公司的Illumina測(cè)序平臺(tái)完成小RNA高通量測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的質(zhì)量 提取的血液Exosome RNA未經(jīng)DNase和RNase處理時(shí)，電泳條帶顯示其存在的RNA主要為5S和少量的18S，而經(jīng)DNase消化后，電泳條帶顯示與未處理時(shí)相同。但經(jīng)RNase處理后，樣品內(nèi)的RNA完全被消化，電泳圖內(nèi)未顯示有任何條帶(圖1)。結(jié)果說明，樣品中提取的RNA降解程度較低，完整性較好，無其他基因組污染，可用于后續(xù)研究。

圖1 總RNA電泳檢測(cè) 1-3：血液Exosome總RNA

圖2 延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中差異表達(dá)miRNAX軸代表比較組，Y軸是對(duì)應(yīng)的小RNA數(shù)。

2.2 miRNA的鑒定 miRNA的鑒定結(jié)果表明：在延邊黃牛血液Exosome中有912條miRNA與成熟的miRNA相匹配，新發(fā)現(xiàn)的miRNA為115條；在韓延牛血液Exosome中有905條miRNA與成熟的miRNA相匹配，新發(fā)現(xiàn)的miRNA為317條。具體結(jié)果見表1。

表1 小RNA的基因組比對(duì)與miRNA鑒定結(jié)果

2.3 miRNA表達(dá)定量 為檢測(cè)延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中miRNA表達(dá)水平，進(jìn)而為后續(xù)的差異分析提供數(shù)據(jù)，對(duì)兩個(gè)牛品種鑒定出的miRNA進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果表明：延邊黃牛中有912個(gè)已知miRNA表達(dá)，韓延牛中有905個(gè)已知miRNA表達(dá)，其中有795個(gè)miRNA在兩個(gè)樣品中都表達(dá)。只在延邊黃牛中表達(dá)的miRNA有112個(gè)，而只在韓延牛中表達(dá)的miRNA有105個(gè)。新miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果分析可知，在兩個(gè)品種中一共檢測(cè)到187個(gè)新miRNA，延邊黃牛中有41個(gè)新miRNA，韓延牛中有146個(gè)新miRNA，其中35個(gè)在兩個(gè)品種中都表達(dá)。只在延邊黃牛中表達(dá)的新miRNA 有6個(gè)，韓延牛中有111個(gè)。

2.4 差異表達(dá)miRNA的篩選 （1）通過比較延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中miRNA的表達(dá)量，篩選差異表達(dá)miRNA，為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)。本試驗(yàn)采用DEGseq進(jìn)行差異miRNA的篩選。篩選的差異miRNA統(tǒng)計(jì)見圖2。結(jié)果表明：延邊黃牛和韓延牛之間差異表達(dá)的miRNA一共是524個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的miRNA為271個(gè)，下調(diào)表達(dá)的miRNA為253個(gè)。（2）本試驗(yàn)對(duì)韓延牛和延邊黃牛之間的524個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行了分析，其中已知miRNA 382個(gè)，新miRNA142個(gè)。相對(duì)于延邊黃牛，在韓延牛中顯著上調(diào)的miRNA有217個(gè)，顯著下調(diào)的miRNA有253個(gè)。表2分別列出了前10個(gè)在兩個(gè)品種中顯著上調(diào)和顯著下調(diào)表達(dá)的 miRNA。

表2 在延邊黃牛與韓延牛血液Exosome 中顯著差異表達(dá)的miRNA

注：顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)：Log2Ratio(Y/H)>1且P<0.05；差異miRNA按照差異倍數(shù)從小到大排序；up：相對(duì)于延邊黃牛，在韓延牛中上調(diào)表達(dá)miRNA；down：為下調(diào)表達(dá)。

2.5 差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 為了更好的研究這些差異miRNA的靶基因，本試驗(yàn)采用RNAhybrid和miRanda靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)獲得差異表達(dá)的524個(gè)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：在延邊黃牛和韓延牛血液Exosome miRNA中共預(yù)測(cè)到52348個(gè)靶基因，并發(fā)現(xiàn)許多miRNA可以靶向多個(gè)靶基因。其中在延邊黃牛中顯著下調(diào)表達(dá)的miR-9-5p靶向的基因是最多的，共靶向 257個(gè)靶基因，其次是在延邊黃牛中顯著上調(diào)表達(dá)的miR-99b，共靶向213個(gè)靶基因。

2.6 差異表達(dá)miRNA的靶基因GO顯著性富集分析 差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因參與的生物學(xué)過程主要包括：行為過程(behavior)、生物粘附(biolo-gial adhesion)、生物相(biological phase)、生物調(diào)控(biological regulation)和細(xì)胞殺傷(cell killing)等(圖3黑色部分)；細(xì)胞組分主要包括：細(xì)胞連接(cell junction)、細(xì)胞組件(cell part)、膠原蛋白三聚體(collagen trimer)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix)等(圖3中灰色部分)；分子功能主要涉及抗氧化活性(antioxidant activity)、結(jié)合功能(bin-ding)、催化性能(catalytic activity)和通道調(diào)控功能(channel regulation activity)等(圖3淺灰色部分)。這些靶基因被富集到3473條生物學(xué)過程，394條細(xì)胞組分以及879條分子功能。

圖3 GO功能分類

2.7 差異miRNA的靶基因Pathway顯著性富集分析 本試驗(yàn)預(yù)測(cè)獲得的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號(hào)通路中，其中最顯著富集的通路為mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路，有635個(gè)靶基因被注釋到該通路中。在本文中只展示富集程度排名前20的pathway條目，具體結(jié)果見圖4和表3。其中發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)品種牛之間顯著差異表達(dá)miR-9-5p和miR-99b調(diào)控的一些靶基因都被注釋到了mTOR信號(hào)通路。

注：RichFactor指差異小RNA的靶基因中位于該pathway條目的基因數(shù)目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數(shù)的比值。從圖4中可以看出RichFactor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做過多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的Pvalue，取值范圍為0到1，越接近于零，表示富集越顯著。

表3 靶基因顯著富集的20條KEGG通路

3 討論與結(jié)論

3.1 有關(guān)延邊黃牛的研究 延邊黃牛是我國(guó)著名五大地方品種之一，屬于山區(qū)役肉兼用型黃牛品種，是我國(guó)畜禽品種基因庫(kù)里寶貴的財(cái)富。延邊黃牛作為東北地區(qū)的優(yōu)良品種，其抗寒性好，耐粗飼，抗病性強(qiáng)，容易育肥，肉質(zhì)嫩而細(xì)膩多汁，肌肉橫斷面呈大理石花紋狀，味道鮮美可口，肉質(zhì)明顯優(yōu)于其他品種的牛，不飽和脂肪酸含量明顯高于其他品種牛，風(fēng)味可與韓牛等媲美，是不可多得、具有中國(guó)特色的肉牛品種[10,11]。但是，延邊黃牛存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，出欄率低等缺點(diǎn)，生長(zhǎng)效率是影響延邊黃牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[12]。因此，對(duì)于怎樣提高延邊黃牛的生長(zhǎng)效率是現(xiàn)在發(fā)展延邊黃牛產(chǎn)業(yè)的至關(guān)重要的問題之一。最近研究表明Exosome與細(xì)胞間通訊交流、免疫調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞、生長(zhǎng)發(fā)育等過程有關(guān)，其組成成分復(fù)雜，如蛋白質(zhì)、脂類和miRNA等[13, 14]。大量研究數(shù)據(jù)表明，來源于各種組織細(xì)胞中的miRNA可通過Exosome進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終到達(dá)靶器官而發(fā)揮作用[15-17]。同時(shí)一些研究者認(rèn)為這種Exosome-miRNA可能是一類新的生物信使。因此，關(guān)于Exosome-miRNA 功能的研究正引起國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。

3.2 關(guān)于靶基因的研究 靶基因預(yù)測(cè)是研究miRNA分子機(jī)制以及生物功能的必要步驟。在生物體中，miRNA與靶基因相互作用是基因表達(dá)調(diào)控中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。一個(gè)miRNA可以調(diào)控不同的靶基因，也可以多個(gè)miRNAs共同調(diào)控一個(gè)基因[18, 19]。因此，研究miRNA 與靶基因相互作用的關(guān)系對(duì)探索miRNA在生物體生長(zhǎng)發(fā)育中的作用具有重要意義。

3.3 關(guān)于RNA-seq的測(cè)序 本試驗(yàn)通過RNA-seq測(cè)序分析，在延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中獲得差異的524個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中上調(diào)表達(dá)的271個(gè)，下調(diào)表達(dá)的253個(gè)。在524個(gè)差異表達(dá)miRNA中共預(yù)測(cè)出52348個(gè)靶基因，并發(fā)現(xiàn)許多miRNA 可以靶向多個(gè)靶基因，如miR-9-5p預(yù)測(cè)到257個(gè)靶基因。一個(gè)miRNA可以調(diào)控不同的靶基因的現(xiàn)象與前人研究相符。

3.4 關(guān)于靶基因的功能及通路分析 （1）為了進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)到的靶基因功能以及miRNA參與的生物學(xué)過程，采用GO富集和KEGG通路分析對(duì)預(yù)測(cè)到的靶基因進(jìn)行分析，獲得相關(guān)的通路。GO富集分析可知差異miRNA的靶基因被富集到3473條生物學(xué)過程，394條細(xì)胞組分以及879條分子功能。但上述靶基因在延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育過程中的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。（2）本試驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行了KEGG通路分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些預(yù)測(cè)得到的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號(hào)通路中，其中排在前兩位富集的通路是mTOR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路。如有635個(gè)靶基因被注釋到mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路，有1046個(gè)靶基因被注釋到MAPK信號(hào)通路。其中顯著差異表達(dá)的miR-9-5p和miR-99b調(diào)控的一些靶基因都被注釋到了mTOR和MAPK信號(hào)通路，因此推測(cè)血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育差異的過程中可能發(fā)揮重要的作用。

因此，下一步研究工作重點(diǎn)將選取2個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)miRNA(miR-9-5p和miR-99b)研究miRNA是如何通過關(guān)鍵信號(hào)通路，特別是mTOR和MAPK信號(hào)通路調(diào)控延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的，從而在分子水平上探討影響延邊黃牛和韓延牛生長(zhǎng)發(fā)育差異的機(jī)制。

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（2019–07–10）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31660614）

S823.9+4

A

1007-1733(2019)10-0006-05