張富友 宋艷 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孫淑紅

禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測方法的建立

張富友 宋艷 徐煜琳 鞠孜敬 崔治中 孫淑紅*

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 山東 泰安 271018）

禽沙門氏菌是常見的一種人畜共患病原菌，快速準確地檢測對于防控沙門氏菌病非常重要。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法準確，但操作繁瑣、費時費力。本研究擬建立準確快速的檢測技術。選擇疑似發(fā)生沙門氏菌病的某種雞群3個批次共計119份未出殼死胚樣品，分別經(jīng)BPW增菌，SC和TTB分別增菌后，再利用XLD鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后，利用PCR方法進行沙門氏菌的分離鑒定。同時，所有樣品均按照國家標準檢測方法(國標法)進行沙門氏菌的分離鑒定。結果顯示，本研究建立的沙門氏菌快速檢測方法與國標法相比，沙門氏菌檢出率均為41.2%，吻合率100%；血清分型試驗顯示，該49株沙門氏菌均為雞白痢沙門氏菌；本研究建立的檢測方法用時3d-6d，而國家標準檢測方法需要6d-9d。本研究表明，禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測技術可準確、快速地完成沙門氏菌的檢測，而且成本更低。該技術方法可用于種雞群沙門菌感染狀態(tài)評估和調(diào)查分析以及規(guī)?；N禽場沙門菌凈化，對生產(chǎn)實踐具有重要的指導意義。

禽沙門氏菌 鑒別培養(yǎng) 國家標準 PCR

禽沙門氏菌病是由不同血清型的沙門氏菌引起的禽類不同類型傳染病的總稱，根據(jù)病原體的抗原結構不同可以分為雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒[1]。禽沙門氏菌在世界各地普遍存在，對養(yǎng)禽業(yè)危害很大[2]。同時，部分血清型的沙門氏菌是人畜共患病原菌，防控禽沙門氏菌病對公共衛(wèi)生有重要意義[3]。

目前國家標準檢測方法(國標法)是用于禽沙門氏菌分離鑒定最常用的方法，該標準可保證檢測結果的準確性，但是在疾病預防和疫情的應急處理中不能夠適用。免疫學檢測方法相比傳統(tǒng)方法省時，靈敏度高，但大部分依賴設備，且對技術人員有一定的要求[4]。本研究擬簡化傳統(tǒng)方法，把鑒別培養(yǎng)和PCR方法結合，既保證檢測結果的準確和靈敏，又操作簡單易行，建立適用于禽沙門氏菌快速鑒定的檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料來源 山東省某種雞群疑似發(fā)生沙門氏菌病，采集三個批次的未出殼死胚送檢，共計119份。

1.2 試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(TTB)、碘液、0.1%煌綠、XLT4瓊脂、亞硫酸鉍瓊脂(BS)均購自青島海博生物技術有限公司；2×Taq Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；沙門氏菌生化鑒定管(GB)購自杭州微生物試劑有限公司；沙門菌屬診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 增菌培養(yǎng) 按照GB 4789.4-2016規(guī)定進行增菌培養(yǎng)。無菌取雞胚肝臟、部分腸段樣品，剪碎，加入BPW預增菌，37℃、220rpm/min培養(yǎng)8~ 18h；然后分別用SC培養(yǎng)基和TTB培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、220rpm/min培養(yǎng)18~24h。

1.4 本研究建立的禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測方法

1.4.1 鑒別培養(yǎng) 取1.3增菌培養(yǎng)后樣品用三線法接種到XLD鑒別培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18~48h。

1.4.2 PCR鑒定 按照參考文獻[5]合成沙門氏菌通用引物FimW，由睿博興科生物技術有限公司合成(引物見表1)，優(yōu)化其PCR反應程序[6]。從XLD培養(yǎng)基上分別挑取4~6個可疑菌落，接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后用培養(yǎng)后的增菌液作為模板，進行PCR方法檢測。

表1 FimW引物序列及片段大小

1.5 禽沙門氏菌檢測的國標法 取1.3增菌培養(yǎng)后的樣品，按照GB 4789.4-2016規(guī)定進行鑒別培養(yǎng)、生化試驗等檢測。

1.6 沙門氏菌分離株的血清型鑒定 按照沙門菌屬診斷血清試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 禽沙門氏菌的鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測方法的檢測結果

2.1.1 疑似沙門氏菌的菌落形態(tài) SC和TTB選擇性增菌培養(yǎng)后，經(jīng)XLD鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，119樣品中有49樣品出現(xiàn)無色半透明菌落，疑似雞白痢沙門氏菌(圖1)。SC+XLD和TTB+XLD組合中可疑菌落比例分別為49/119和45/119。

圖1 疑似雞白痢沙門氏菌的菌落形態(tài)

2.1.2 PCR鑒定結果 用FimW引物進行PCR鑒定結果表明，49株疑似沙門氏菌樣品均檢測為陽性（圖2）。

圖2 部分樣品的PCR檢測結果

2.2 禽沙門氏菌的國標法檢測結果

2.2.1 疑似沙門氏菌的菌落形態(tài) SC和TTB選擇性增菌培養(yǎng)后，經(jīng)XLD和BS鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，119樣品中，XLD培養(yǎng)基中出現(xiàn)無色半透明菌落，BS培養(yǎng)基上出現(xiàn)黑色或灰色有金屬光澤的菌落，SC+XLD、SC+BS、TTB+XLD和TTB+BS 4個組合中疑似雞白痢沙門氏菌感染的比例分別為49/119、11/119、45/119和15/119國標法共分離到49株疑似沙門氏菌菌株。

2.2.2 生化試驗結果 從2.2.1中4個組合的XLD和BS培養(yǎng)基上分別挑取2個以上可疑菌落進行生化試驗鑒定，結果表明，大部分樣品三糖鐵瓊脂斜面呈紅色(產(chǎn)堿)，底層呈黃色(產(chǎn)酸)，部分樣品產(chǎn)氣，沒有樣品產(chǎn)H2S，大部分樣品賴氨酸呈紫紅色(陽性)，少數(shù)呈黃色(陰性)，全部樣品蛋白胨水、尿素、氯化氫呈陰性，為A3反應，需要補做ONPG。ONPG結果全部為陰性，表明該種雞群分離鑒定的49株可疑菌株全部為沙門氏菌。

2.3 禽沙門氏菌分離株的血清型鑒定結果

血清分型試驗顯示，49株沙門氏菌O9；O12抗原凝集，為D群沙門氏菌；半固體培養(yǎng)基穿刺結果表明，全部菌株沒有生長出鞭毛；結果表明，全部沙門氏菌為雞白痢沙門氏菌。

3 討論

3.1 兩種檢驗方法的耗時比較

本研究建立的方法是通過前增菌、增菌、劃線培養(yǎng)、菌液PCR和血清學試驗，耗時約3~6d，可一人獨立完成；國標檢測通過前增菌、增菌、劃線培養(yǎng)、生化試驗和血清學試驗，耗時約6~9d時間，但是生化試驗需要兩人操作(一人獨立完成需增加1d)。生產(chǎn)中如果只針對沙門氏菌陽性率檢驗，可以省去血清學試驗，實驗室方法大約使用3d左右的時間，國標法則大約需要6d。綜上所述，本研究建立的方法更省時。

3.2 靈敏度、特異性的比較

實驗室建立的方法共分到49株沙門菌，國標法(GB 4789.4-2016)共分到49株沙門菌，二者沙門氏菌分離率一致，無差異。

3.3 資金費用的比較

本研究建立的檢測技術更經(jīng)濟實惠。僅用XLD培養(yǎng)基完成鑒別培養(yǎng)[6]，而國標法中應用XLD和BS兩種鑒別培養(yǎng)基；同時，用優(yōu)化的PCR方法代替了國標法的耗時費力且成本高的生化試驗。

3.4 操作便捷的比較

前期試驗證明，XLD培養(yǎng)基對禽沙門氏菌分離效果比BS培養(yǎng)基好，并且分離株包含BS培養(yǎng)基中分離到的菌株、XLD培養(yǎng)基可以取代BS培養(yǎng)基來實現(xiàn)禽沙門氏菌的分離鑒定。PCR方法更便捷，優(yōu)于生化試驗。兩種方法中前增菌、增菌工作相同；PCR檢測需要用菌落或菌液做模板，PCR反應完成后瓊脂糖凝膠電泳；而生化試驗則需要準備三糖鐵斜面、營養(yǎng)瓊脂平板，操作過程中每個樣品需要依次經(jīng)過三糖鐵斜面劃線和穿刺、接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂，同時需要接種蛋白胨水、尿素瓊脂和氰化鉀培養(yǎng)基，然后根據(jù)初步判斷結果，判斷是否需要補做后續(xù)試驗，該操作過程非常繁瑣，需要兩個人共同完成，中間容易出差錯。

綜上所述，本研究建立的禽沙門氏菌鑒別培養(yǎng)基和PCR檢測方法優(yōu)于國標法，具有準確快速、操作方便等優(yōu)點，可作為沙門菌感染狀態(tài)評估和調(diào)查分析以及規(guī)模化種禽場沙門菌凈化所需的檢測技術。

[1] 初莉莉. 雞沙門氏菌病的防治[J]. 獸醫(yī)導刊, 2017(3).

[2] 張眾. 一例由禽沙門氏菌引起的雛雞疾病診治[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2017(11): 113-113.

[3] 華玉新. 肉仔雞沙門氏菌的分離鑒定與防治[J]. 獸醫(yī)導刊, 2017(22):124-125.

[4] 趙春陽, 江強世, 劉暢等. 沙門氏菌檢測方法研究進展[J]. 中國奶牛, 2018(10): 27-31.

[5] 張江英, 董立偉, 王小舟等. 針對fimW基因沙門菌的特異性PCR檢測[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2013, 35(10): 837-839.

[6] 張富友, 宋艷, 崔治中等. 禽沙門菌分離鑒定方法的建立與優(yōu)化[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2019, 40(8): 1-4.

（2019–09–29）

國家十三五重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0501608）；山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術創(chuàng)新項目（SD2019XM009）

S852.61+2

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