近年來,隨著我國老齡化進程的加快以及生態(tài)環(huán)境的惡化,老年支氣管哮喘的發(fā)病率、死亡率呈遞增趨勢。老年哮喘發(fā)病機制復(fù)雜,目前暫無特異性的治療方法。研究者認為哮喘與氣道重塑、平滑肌收縮、肥大細胞的活化脫顆粒等有關(guān),受炎癥因子、基因多態(tài)性的影響[1]。據(jù)報道,1-磷酸鞘氨醇(S1P)通過S1P/鞘氨醇激酶信號通路促進炎癥介質(zhì)釋放，誘導應(yīng)力纖維形成，促進氣道平滑肌和纖維細胞生長分化，導致氣道重塑[2];嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)通過引發(fā)嗜酸性的粒細胞炎癥誘導哮喘發(fā)生[3];纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)基因4G/5G基因型是老年哮喘發(fā)病的易感基因,通過加重細胞外基質(zhì)沉積促進氣道重塑進程[4]。S1P、Eotaxin水平及PAI-1基因多態(tài)性均與哮喘氣道高反應(yīng)性和氣道重塑有關(guān),而PAI-1基因多態(tài)性是否與S1P、Eotaxin水平有關(guān),目前臨床報道較少。本研究探討S1P、Eotaxin水平在不同PAI-1基因型老年支氣管哮喘中的表達差異及與氣道高反應(yīng)及肺功能的相關(guān)性,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 病例資料

1.1 基本資料 選取我院2017年1月至2018年1月收治的55例緩解期老年哮喘病人作為哮喘組,男30例,女25例,年齡65～90歲,平均(76.1±3.5)歲,病程2～17年,平均(12.2±2.2)年。另選擇同期來我院體檢的50例健康人群作為對照組,男30例,女20例,年齡65～90歲,平均(75.2±3.1)歲。2組性別、年齡等基線資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究獲得我院倫理委員會批準。

納入標準:(1)符合《中國支氣管哮喘防治指南 (基層版)》中的哮喘診斷標準[5];(2)年齡≥60歲;(3)無其他呼吸系統(tǒng)疾病合并癥;(4)所有病人及其家屬知情同意,并簽署知情同意書。

排除標準:(1)合并嚴重肝、腎、心腦血管疾病者;(2)入組前4周使用全身糖皮質(zhì)激素者;(3)入組前1周使用抗組胺、抗白三烯及緩釋茶堿藥物者;(4)合并肺炎、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病或其他部位炎癥病人;(5)合并腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 PAI-1基因型檢測:入院次日,取空腹肘靜脈血2 mL,EDTA抗凝,采用STMT緩沖液處理,采用苯酚/氯仿法提取DNA。引物序列:擴增序列位于5’端啟動子區(qū)域,上游、下游引物分別為:5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCAGT-3′、5′-CAGCCACGTGATTGTCTAGGT-3′。PCR擴增反應(yīng)條件:25μL反應(yīng)體系(含100 ng基因組DNA、0.3μmol引物、1.0 U的Tag DNA聚合酶),94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃/30 s、57 ℃/30 s、72 ℃/30 s循環(huán)35次,72 ℃延伸10 min;采用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,25μL反應(yīng)體系(5μL PCR擴增產(chǎn)物,10 U限制性內(nèi)切酶BseLI),37 ℃持續(xù)3 h,采用12%的PAGE電泳分型,硝酸銀染分析基因型。共產(chǎn)生3種基因型: 5G/5G 、4G/5G、4G/4G,分別產(chǎn)生2(96bp、46bp)、3(74 bp、46 bp、22 bp)、4(96 bp、74 bp、46 bp、22 bp)條帶。

1.2.2 血清PAI、S1P、Eotaxin檢測:取空腹肘靜脈血,置于肝素抗凝管中,37 ℃孵育10 min,3000 r/min離心10 min,取上層血清,采用ELISA測定血清PAI、S1P、Eotaxin水平,具體操作參照試劑盒(購自于上海信帆生物科技有限公司)說明書進行。

1.2.3 氣道反應(yīng)性評估:采用德國JEAGER公司的定量霧化裝置、日本美能的AS-407肺功能儀及激發(fā)藥物磷酸組織胺測定哮喘病人氣道反應(yīng)性,具體步驟如下:病人依次吸入生理鹽水、0.01/0.02/0.04/0.16/0.26/0.68/1.27 mg的激發(fā)藥物,每吸入1劑2 min后測定第1秒用力呼氣量(FEV1),然后吸入下一劑量,直至FEV1下降20%或最高吸入劑量累計達到2.44 mg。數(shù)據(jù)評估:若累計劑量低于2.44 mg,FEV1降低20%視為激發(fā)試驗陽性,記錄激發(fā)藥物累計劑量(PD20)。參照氣道反應(yīng)性分級標準,采用PD20評估氣道高反應(yīng)性:極輕度(PD20在0.99～2.20 mg)、輕度(PD20在0.25～0.98 mg)、中度(PD20在0.03～0.24 mg)和重度(PD20<0.03 mg)。

1.2.4 肺功能評估:采用德國Yeager肺功能檢測儀器測定哮喘病人FEV1和用力肺活量(FVC),計算FEV1/FVC,采用FEV1/FVC評估病人肺功能。

2 結(jié)果

2.1 支氣管哮喘病人與健康人群PAI-1基因型分布、S1P、Eotaxin、PAI-1水平比較 哮喘組與對照組PAI-1基因型分布、S1P、Eotaxin、PAI-1水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),哮喘組PAI-1基因型以4G/4G為主,血清S1P、Eotaxin、PAI-1水平高于對照組。見表1。

表1 支氣管哮喘病人與健康人群PAI-1基因型分布及S1P、Eotaxin、PAI-1水平比較

注：與哮喘組比較，**P<0.01

2.2 不同PAI-1基因型病人S1P、Eotaxin、PAI-1水平比較 老年哮喘病人不同PAI-1基因型血清S1P、Eotaxin、PAI-1水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),基因型4G/4G的病人血清S1P、Eotaxin、PAI-1水平顯著高于基因型為4G/5G、5G/5G的哮喘病人。見表2。

PAI-1基因型PAI-1(ng/mL)S1P(mmol/L)Eotaxin(μg/L)4G/4G(n=24)64.32±3.47?2.48±0.190.139±0.0334G/5G(n=25)52.12±3.121.40±0.10?0.099±0.011?5G/5G(n=6)51.82±3.921.41±0.08?0.099±0.014?

注:與4G/4G組比較,*P<0.05

2.3 PAI-1、S1P、Eotaxin與氣道反應(yīng)性、肺功能相關(guān)性分析 單因素、Logistic回歸分析顯示,吸煙史(定義無吸煙史=1,有吸煙史=2)、PAI-1基因型(定義5G/5G=1,4G/5G=2,4G/4G=3)、PAI-1水平(定義“PAI-1< 49 ng/mL”=1,“PAI-1≥49 ng/mL”=2)、S1P水平(定義“S1P<1.42 mmol/L”=1,“S1P≥1.42 mmol/L”=2)、Eotaxin水平(“Eotaxin<0.1μg/L”=1,“Eotaxin≥0.1μg/L”=2)均與氣道反應(yīng)性(定義極輕度和輕度=1,中度和重度=2)、肺功能(定義“FEV1/FVC≥55%”=1,“FEV1/FVC<55%”=2)顯著相關(guān)(P<0.05),是影響氣道反應(yīng)性、肺功能的獨立危險因素。見表3、4、5。

2.4 PAI-1與S1P、Eotaxin相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示,PAI-1基因型(定義5G/5G=1,4G/5G=2,4G/4G=3)、PAI-1水平與S1P、Eotaxin呈顯著正相關(guān)(r=0.455～0.653,P<0.05);S1P與Eotaxin呈顯著正相關(guān)(r=0.705,P<0.001)。見表6。

表3 影響氣道反應(yīng)性、肺功能的單因素分析

注:項目組內(nèi)比較,*P<0.05

3 討論

支氣管哮喘是在環(huán)境因素、遺傳因素共同作用引起的慢性氣道炎癥,進而出現(xiàn)氣道結(jié)構(gòu)和功能變化,即氣道重塑。氣道重塑和炎癥反應(yīng)密不可分,但多數(shù)學者認為氣道重塑是炎癥長期作用的結(jié)果[6]。然而,遺傳學研究表明,氣道重塑和炎癥反應(yīng)同時作用,共同介導了支氣管哮喘的疾病進程[7],但二者如何相互作用,導致哮喘進展,業(yè)界尚未形成共識。

隨著遺傳學研究的深入,人們發(fā)現(xiàn),基因多態(tài)性與氣道重塑密切相關(guān)[8]。PAI-1是纖維蛋白溶解系統(tǒng)的主要抑制劑,PAI-1基因調(diào)控血漿PAI-1的表達,抑制纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶,導致細胞外基質(zhì)沉積,產(chǎn)生氣道重塑。據(jù)報道,PAI-1基因是影響血清PAI-1水平的主要基因因素,PAI-1基因4G/5G的基因多態(tài)性與哮喘相關(guān),其中4G/4G為哮喘的易感基因型[9]。本研究中,哮喘病人與健康人群PAI-1基因型存在差異,哮喘病人以4G/4G基因型為主;4G/4G基因型病人肺功能較4G/5G、5G/5G差,氣道高反應(yīng)性程度高,證實了PAI-1基因型與肺功能、氣道反應(yīng)性存在相關(guān)性。PAI-1基因調(diào)控血漿PAI-1的表達,其中4G/4G易感基因型病人血漿PAI-1表達較高。高表達的PAI-1除了通過抑制纖維蛋白溶解誘導氣道重塑之外,還通過以下途徑發(fā)揮作用：(1)抑制凝血酶、金屬蛋白酶抑制細胞外基質(zhì)降解;(2)降低轉(zhuǎn)化生長因子-β釋放,促進膠原合成;(3)促進新生血管生成,與嗜酸性粒細胞、肥大細胞形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò),促進氣道重塑[10],導致病人肺功能變差。

炎癥反應(yīng)是誘發(fā)哮喘和氣道重塑的另一重要原因。S1P是鞘磷脂代謝產(chǎn)物[11],由巨噬細胞、肥大細胞分泌,通過促進支氣管評價細胞收縮和應(yīng)力纖維形成，誘導肥大細胞活化以及促進氣道纖維細胞、平滑肌細胞生長分化成肌成纖維細胞,導致炎性介質(zhì)滲出,出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)。Eotaxin是趨化因子家族成員[12],通過選擇性趨化嗜酸性粒細胞,趨使其向炎癥部位靠攏而誘發(fā)哮喘和氣道高反應(yīng)性。據(jù)報道[13],急性發(fā)作哮喘病人血清SIP和Eotaxin水平急劇升高。本研究中,哮喘病人血清SIP和Eotaxin高于健康人群,且血清SIP和Eotaxin是氣道高反應(yīng)性、肺功能減弱的獨立危險因素,提示血清SIP和Eotaxin嚴重影響哮喘疾病進程。

表4 影響氣道反應(yīng)性的Logistic回歸分析

表5 影響肺功能的Logistic回歸分析

表6 PAI-1與S1P、Eotaxin相關(guān)性分析(r)

PAI-1基因型、血清SIP和Eotaxin均與老年支氣管哮喘氣道高反應(yīng)性、肺功能密切相關(guān),但二者之間的相關(guān)性研究報道仍較少。本研究中,基因型4G/4G的病人血清S1P、Eotaxin水平顯著高于基因型為4G/5G、5G/5G的哮喘病人,相關(guān)性分析顯示,S1P與Eotaxin呈顯著正相關(guān),PAI-1基因型(定義基因型5G/5G=1,4G/5G=2，5G/5G=3)、PAI-1水平與S1P、Eotaxin呈顯著正相關(guān),提示PAI-1基因型與炎癥反應(yīng)相互作用,共同介導哮喘的氣道高反應(yīng)性和肺功能下降,從而導致氣道重塑。PAI-1位于7q2.13-2.2,它的3種多態(tài)性與血清PAI-1水平相關(guān)。PAI-1 4G/4G上調(diào)PAI-1的表達,一方面促進氣道分泌金屬蛋白酶-9增加,另一方面促進肺泡上皮細胞分泌白細胞介素-8(IL-8)、白三烯B4(LTB-4)等上游促炎因子,趨化炎癥細胞,共同加重炎癥反應(yīng),介導巨噬細胞、肥大細胞等分泌SIP、Eotaxin等炎癥因子,形成炎性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),協(xié)同加重哮喘。

總之,PAI-1基因型、S1P、Eotaxin是影響老年支氣管哮喘氣道高反應(yīng)性、肺功能的主要因素,PAI-1基因型與S1P、Eotaxin之間具有相關(guān)性,共同介導哮喘的進展,詳細的PAI-1基因型調(diào)控S1P、Eotaxin表達的機制有待于后續(xù)研究。因此,對于老年支氣管哮喘的治療,應(yīng)同時抑制PAI-1基因型引起的血清PAI-1及S1P、Eotaxin的高表達,提高療效。