涂龍霞，查道德，李蓓莉

(淮北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，安徽 淮北 235000)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年有超過一百萬胃癌新發(fā)病例，八十萬死亡病例[1]，而且胃癌也是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[2]，每年新增胃癌患者和死亡人數(shù)占三分之一[3]。胃癌中絕大部分屬于胃腺癌，因此對人類的生命造成了嚴(yán)重的威脅。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)是一種新型凋亡誘導(dǎo)分子，是Wiley發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，不引起正常細(xì)胞凋亡，可選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。Cat B是一個相對分子質(zhì)量為40000～45000的半胱氨酸蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族，廣泛分布于多種組織細(xì)胞的溶酶體中，在多種腫瘤組織中也有明顯表達(dá)[4-5]。研究表明，當(dāng)溶酶體內(nèi)Cat B釋放到細(xì)胞質(zhì)后可使Bid表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明Cat B可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[6-7]。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過觀察Cat B在TRAIL誘導(dǎo)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中的表達(dá)變化，探討Cat B在TRAIL誘導(dǎo)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料人胃癌細(xì)胞系SGC-7901購自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)于細(xì)胞生物學(xué)研究所；人重組可溶性TRAIL購自Bioscience公司；MTT試劑和碘化丙啶均購自美國Sigma公司；Cat B特異性抑制劑CA-074(Me)購自美國CALBIOCHEM公司；鼠抗人Cat B單抗購自美國Merck公司，羊抗小鼠二抗購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901在含10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基、37℃、5%CO2的條件下傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將胃腺癌SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板各孔中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105，分別加入不同濃度的TRAIL(0、20、60、100、150、200μg/L)進(jìn)行孵育48h，同時設(shè)立DMEM對照組。為了提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每組設(shè)3個平行復(fù)孔。48h后，細(xì)胞中加入新配制的濃度為5g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸除上清液，每孔加DMSO溶液150μL，振蕩混勻，避光條件下反應(yīng)10min，在570nm波長處測吸光度值(A)，并計(jì)算細(xì)胞抑制率，CI(%)=(1-藥物組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的變化 將胃腺癌SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板各孔中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105，每孔加入100μg/L TRAIL和不同濃度Cat B特異性抑制劑CA-074(Me)(0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)，培養(yǎng)48h后收集各孔上清液至流式細(xì)胞管中，每孔加1mL預(yù)冷的PBS洗滌一次，離心棄上清。同時每孔加750μL PI溶液，室溫下避光孵育20min。收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。WinMDI 2.9軟件分析二倍體峰(subG1)所占的百分率及細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot方法檢測細(xì)胞中Cat B蛋白變化 將胃腺癌SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板各孔中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105，每孔加入100μg/L TRAIL和不同濃度Cat B特異性抑制劑CA-074(Me)(0、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L)，同時設(shè)立DMEM對照組。培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌兩遍，加入細(xì)胞裂解液，放在冰上裂解30min后，40℃、14000r/min離心20min，吸取上清液獲得細(xì)胞總蛋白。取定量好的細(xì)胞總蛋白與2×蛋白電泳上樣緩沖液等量混合，放在100℃孵育器中煮沸3min備用。配好分離膠及濃縮膠后，將變性蛋白樣品加入上樣孔中，保證每泳道上樣量相等，SDS-PAGE電泳。取出蛋白凝膠，洗滌后，放在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡10min，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶/TBST封閉2h后，加入一抗鼠抗人Cat B(1∶1000稀釋)、二抗羊抗鼠HRP-IgG(1∶10000稀釋)依次反應(yīng)，用ECL試劑盒進(jìn)行顯影曝光，以β-actin為內(nèi)參，掃描圖像保存。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Image J分析各條帶灰度值，以各目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參條帶的灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，P<0.05時為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用檢測結(jié)果用不同濃度TRAIL(0、20、60、100、150、200μg/L)作用于SGC-7901細(xì)胞后，從表1可以看出，隨著TRAIL濃度增大，對細(xì)胞抑制率逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞增殖反應(yīng)差異有顯著性(P<0.05)。其中，TRAIL作用48h有效半抑制濃度(50%，IC50)為100μg/L，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，TRAIL我們選用濃度100μg/L、48h的作用時間為抑制SGC-7901細(xì)胞生長的最適濃度和處理時長。

表1 不同濃度TRAIL誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞48h的A值和細(xì)胞抑制率

注： 與對照組相比，*P<0.05；對照組和不同濃度組相比，#P<0.01。

2.2 Cat B特異性抑制劑CA-074(Me)對SGC-7901細(xì)胞凋亡率影響作用檢測結(jié)果細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，經(jīng)TRAIL處理后的SGC-7901細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，經(jīng)TRAIL和CA-074(Me)共同處理后細(xì)胞凋亡率下降，且隨著CA-074(Me)濃度升高，細(xì)胞凋亡率下降更明顯(見圖1),說明Cat B在TRAIL誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中有一定調(diào)控作用。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測100μg/L TRAIL和不同濃度CA-074(Me)誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞48h的凋亡率

注：與對照組相比，**P<0.01;與TRAIL組相比，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 Western blot方法檢測細(xì)胞中Cat B蛋白變化結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100μg/L TRAIL作用后細(xì)胞中Cat B高表達(dá)；相對于TRAIL組，經(jīng)TRAIL和CA-074(Me)共同處理后，蛋白表達(dá)量下降，且隨著CA-074(Me)濃度增大，Cat B表達(dá)量逐漸下降。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 100μg/L TRAIL和不同濃度CA-074(Me)作用SGC-7901細(xì)胞后Cat B蛋白表達(dá)率

注：與TRAIL+ CA-074(Me) 組相比，*P<0.05;與其他濃度組相比，#P<0.05。

圖2 Western blot檢測100μg/L TRAIL和不同濃度CA-074(Me)作用SGC-7901細(xì)胞Cat B蛋白表達(dá)結(jié)果

注：1：0 μmol/L；2：0.2 μmol/L；3：0.5 μmol/L；4：1.0 μmol/L；5：2.0 μmol/L；6：4.0 μmol/L

3 討論

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)又稱 Apo2L，在多種正常組織中都廣泛表達(dá)，且在多種因子如絲裂原、白細(xì)胞介素、干擾素及炎癥性的細(xì)胞毒素等的刺激下可被誘導(dǎo)表達(dá)。TRAIL不引起正常細(xì)胞凋亡，可選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡， 成為一種具有開發(fā)前景的癌癥治療藥物，我們在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中也會繼續(xù)研究TRAIL的作用機(jī)制。

多年來的研究表明，半胱氨酸蛋白酶 Cat B生理情況下約10%酶原被分泌至胞質(zhì)，病理狀態(tài)下，大量Cat B釋放到胞質(zhì)或組織間隙并被激活，介導(dǎo)細(xì)胞炎性壞死及凋亡的發(fā)生[8]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Cat B不僅可以通過蛋白水解功能發(fā)揮促腫瘤作用，還可以通過與其他分子或藥物發(fā)生相互作用引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮促腫瘤作用[9-10]。晚期癌癥患者與健康人相比，Cat B明顯呈高表達(dá)狀態(tài)。前期多組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌中Cat B表達(dá)明顯增高[11-12]。Ebert等研究發(fā)現(xiàn)，大部分胃腺癌中Cat B高表達(dá)[13]。在本實(shí)驗(yàn)中我們通過應(yīng)用Cat B特異性抑制劑CA-074(Me)來研究Cat B在TRAIL誘導(dǎo)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中的調(diào)控作用。將CA-074(Me)、TRAIL與SGC-7901細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測細(xì)胞增殖、凋亡情況，并測定細(xì)胞中Cat B表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，單獨(dú)使用TRAIL能使SGC-7901細(xì)胞活力下降、細(xì)胞凋亡率明顯上升。而加入CA-074(Me)和TRAIL的SGC-7901細(xì)胞與單獨(dú)使用TRAIL相比，細(xì)胞活力明顯上升，細(xì)胞凋亡率明顯下降，且隨著CA-074(Me)濃度增大，細(xì)胞凋亡率下降越明顯。根據(jù)Western blot結(jié)果顯示，單獨(dú)使用TRAIL組的Cat B蛋白高表達(dá)，而使用CA-074(Me)后細(xì)胞中Cat B蛋白的表達(dá)有明顯減少，且隨著CA-074(Me)濃度的增大，蛋白減少越明顯，但 2.0μmol/L與4.0 μmol/L之間的減少趨勢在縮小。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)從不同角度證實(shí)了Cat B在TRAIL誘導(dǎo)胃腺癌SGC-7901細(xì)胞凋亡過程中具有一定的調(diào)節(jié)作用，在后續(xù)的研究中，我們會進(jìn)一步探究Cat B在TRAIL誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡中的具體作用機(jī)制，為臨床控制和治療胃腺癌提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。