陶 俊，寇 碩，唐小云

(1.牡丹江醫(yī)學院；2.牡丹江醫(yī)學院病原教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

生姜是姜科植物姜的新鮮根莖，其性味辛溫，具有祛風、解表、和胃、溫經(jīng)止痛的功效，是我國中醫(yī)藥常用的藥食兩用的材料，素有“生姜治百病”、“冬吃蘿卜夏吃姜”之說。生姜除了作為食品加工過程中的主要佐料，在民間還被廣泛應用于治療風寒感冒、頭痛鼻塞、嘔吐、風濕性關節(jié)炎、便秘，以及用于食物防腐等方面[1]。

人體的消化道是營養(yǎng)吸收的主要途徑，也是治療用藥最方便和最主要的途徑。生姜最方便的使用途徑就是直接食入經(jīng)消化道發(fā)揮作用。而消化道寄生著大量的微生物，據(jù)估計人體結腸細菌數(shù)量為3.8×1013個，比身體其他部位正常菌群總量至少高2個數(shù)量級，因此可以把結腸細菌數(shù)量看作人體細菌的總量[2]。這些微生物在正常情況下和機體形成共生的關系，對機體有益無害，具有拮抗致病菌、免疫促進、營養(yǎng)、抗腫瘤等作用。

消化道用藥一方面要考慮到對消化道細菌的影響，另一方面要考慮消化道細菌對藥物的作用。生姜作為臨床常用中藥，經(jīng)過消化道給藥，對腸道菌群的影響卻少見報道。因此本實驗通過給小鼠灌胃生姜煎煮液，觀察生姜對小鼠腸道菌群的影響，并進一步研究生姜對小鼠腸道局部免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 生姜煎煮液的制備取生姜100g，除去泥沙和雜質，洗凈切片，加10倍量水煎煮1h，用紗布濾出藥液。濾渣再加水反復煎煮3次，每次過濾取濾液。最后合并4次濾液，并濃縮至濃度為0.25g/mL、0.5g/mL、1g/mL。

1.2 試劑IL-2 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；SIgA ELISA試劑盒購自北京尚柏生物醫(yī)學技術有限公司；Oxoid酵母粉購自上海根生生物科技有限公司；無菌均質袋、2.5 L厭氧產(chǎn)氣包、EMB瓊脂培養(yǎng)基(伊紅美蘭培養(yǎng)基)、EC(腸球菌)瓊脂、LBS(乳酸桿菌培養(yǎng)基)瓊脂、BS(雙歧桿菌)瓊脂均購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 動物分組及處理昆明鼠40只，體重18～22g，雌雄各半，由牡丹江醫(yī)學院實驗動物中心提供，隨機分為4組，每組10只。NC 組為正常對照組，每日灌胃蒸餾水0.25mL，連續(xù)15d。H、M、L 3組為生姜高、中、低劑量組，參照王慧芳等[3]報道，每日分別灌胃濃度為1g/mL、0.5g/mL 、0.25g/mL生姜煎煮液 0.25mL，每日1次，連續(xù)15d。

表1 腸道細菌培養(yǎng)基和稀釋度的選擇及其他培養(yǎng)條件

1.5 腸粘膜表面SIgA的檢測無菌取靠近回盲部的腸段1.5cm，縱向剖開，用生理鹽水反復沖洗腸腔表面后，用載玻片輕刮黏膜表面黏液至EP管中，再加入0.01mol/L的PBS 0.5mL，充分混勻后，10000rpm離心15min，吸取上清-20℃保存待測。腸粘膜SIgA的檢測采用ELISA法，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.6 腸組織IL-2的檢測無菌取出小腸，用生理鹽水沖洗腸腔后，每100mg腸組織加入0.5mL PBS(PH7.4)進行勻漿，然后4℃、10000rpm離心40min，吸取上清液-20℃保存待測。腸組織勻漿上清液IL-2的檢測采用ELISA法，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學分析應用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，多組樣本均數(shù)的兩兩比較采用ANOVA分析(方差齊時，采用LSD-t檢驗，方差不齊時，采用Games-Howell法)，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般狀態(tài)觀察正常對照組及生姜煎煮液高、中、低3個劑量組小鼠均活動靈敏，進食正常，僅生姜中劑量組1只小鼠灌胃時誤入氣管導致死亡，同樣條件下補充1只。

2.2 生姜對小鼠腸道菌群的影響EMB瓊脂培養(yǎng)基(伊紅美蘭培養(yǎng)基)、EC瓊脂培養(yǎng)基、LBS瓊脂培養(yǎng)基和BS瓊脂培養(yǎng)基，分別用于大腸桿菌、腸球菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的培養(yǎng)。結果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比較，生姜煎煮液高、中、低3個劑量組小鼠腸道大腸桿菌和腸球菌數(shù)量明顯減少，差異具有顯著性差異(P<0.05)，生姜煎煮液大劑量組減少最為明顯， 3個劑量組的大腸桿菌和腸球菌沒有顯著差異(P>0.05)。與正常對照組相比較，生姜煎煮液3個劑量組的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量均明顯增加，具有顯著性差異(P<0.05)，大劑量組減少最為明顯，3個劑量組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

表2 生姜對小鼠腸道菌群的調節(jié)作用

注：與NC組相比較，*P<0.05

2.3 生姜對小鼠腸道局部免疫功能的影響ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比較，生姜煎煮液3個劑量組的腸黏膜表面的SIgA和腸組織勻漿上清IL-2的水平都明顯提高，差異具有顯著性(P<0.05)，生姜煎煮液3個劑量組中高劑量組提高最為明顯，3組間無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 生姜煎煮液對腸粘膜SIgA及腸組織勻漿上清IL-2的影響

注：與NC組相比較，*P<0.05

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明生姜具有抗氧化、降低膽固醇、利膽保肝、消炎鎮(zhèn)痛、抗菌防腐、抗腫瘤、健胃止吐、抗血栓等多種作用。生姜中主要的有效成分以姜辣素、姜精油和二苯基庚烷為主[4-5]。生姜發(fā)揮其營養(yǎng)、保健、治療作用的主要靠這些生物活性成分參與機體生化反應體系，調節(jié)脂肪氧合酶、細胞色素酶、12-合成酶等關鍵性酶類的生物合成和代謝，平衡前列腺素、血栓素等體內(nèi)重要的生物活性物質[6-7]。

生姜還具有抑菌作用，因此常用于食物，尤其是肉類的防腐保存。申曉慧研究發(fā)現(xiàn)生姜乙醇提取物對常見的食品污染菌金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和大腸桿菌都具有良好的抑制作用[8]。張云玲等研究發(fā)現(xiàn)，6-姜酚對體外抗幽門螺桿菌的作用很強，標準品6-姜酚的最小抑菌濃度可達到0.02 mg/mL。其機制可能是6-姜酚與Hp 生長所需酶發(fā)生了相互作用，抑制了Hp 的生長[9]。

體外實驗中發(fā)現(xiàn)生姜對多種細菌具有抑制作用，那么，體內(nèi)應用時對腸道細菌是否是單純的抑制作用呢？李楚杰等[10]進一步發(fā)現(xiàn)，給小鼠消化道給藥干姜能增加腸道菌群物種的數(shù)量。我們在進行動物體內(nèi)實驗的研究中也發(fā)現(xiàn)，每日給小鼠分別灌胃生姜煎煮液1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL 0.25mL(即12.5g/kg、6.25g/kg 和3.125g/kg)，對腸桿菌和腸球菌有抑制作用，而能增加腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，與張金輝等人[11]的研究一致。這些研究表明生姜在消化道不是單純起到抑制細菌的作用，而是對腸道細菌的種群和數(shù)量具有調節(jié)作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)生姜能增加益生菌的數(shù)量，這可能與生姜的藥理作用有關，具體機制還有待進一步研究。

SIgA存在于分泌液中，如唾液、淚液、初乳、鼻和支氣管分泌液、胃腸液等。SIgA是機體粘膜局部抗感染免疫的主要抗體[12]。IL-2主要由Th1細胞產(chǎn)生，能夠促進B細胞、T細胞分化，活化NK細胞、巨噬細胞，是最重要的細胞因子之一[13]。因此，局部的SIgA和IL-2能很好地代表機體局部組織的免疫功能。熊平源等[14]研究發(fā)現(xiàn)生姜能促進脾細胞抗體的生成、增加小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性及細胞毒活性，增強NK細胞殺傷活性等。劉輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)生姜醇提物能明顯升高脾臟指數(shù)，提高荷瘤鼠巨噬細胞吞噬率，升高IgM水平，明顯改善荷瘤鼠免疫功能低下的狀態(tài)。但是生姜對腸道局部免疫功能的研究未見報道。我們通過檢測腸道黏膜表面SIgA和小腸組織勻漿上清中IL-2的水平，發(fā)現(xiàn)生姜能提高小鼠腸道局部免疫功能。生姜對腸道菌群的調節(jié)作用和生姜增強腸道局部免疫功能之間的聯(lián)系還需要進一步探討。