張東雪，路靜

心血管疾病發(fā)病率逐年增加，血管鈣化是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)病率增加的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。Wang等［2］研究發(fā)現(xiàn)引起血管鈣化的諸多因素中，高磷血癥為始動因素，高磷可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致血管鈣化的發(fā)生。尋找高磷因素誘導(dǎo)的血管鈣化的機(jī)制，對于臨床診治有重要價(jià)值。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET8是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的唯一能夠特異性催化組蛋白H4第20位的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（H4K20），可甲基化p53、TWIST等非組蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)分化等［3］?，F(xiàn)SET8在血管鈣化中的作用研究較少，且機(jī)制不明確。本研究旨在以大鼠VSMCs為研究對象，探討SET8在高磷誘導(dǎo)VSMCs鈣化中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和增強(qiáng)型ECL試劑盒購自美國Therom公司；SET8-短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒購自廣州復(fù)能基因有限公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；PI/Annexin V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；鼠單克隆抗體SET8、p53和兔單克隆抗體Bax、Caspase3與兔多克隆抗體Bcl-2均購自英國Abcam公司；兔單克隆抗體GAPDH購自美國Bioworld公司；兔二抗與鼠二抗購自美國KPL公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱、RT-PCR儀和蛋白電泳儀購自美國Therom公司，凝膠成像儀購自美國Proteinsimple公司，倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽渑c分組 選取6只清潔級SD大鼠，均為健康雄性，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心（證書號：1305090）。取大鼠胸主動脈，剝離棄去血管內(nèi)外膜，取中膜，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，細(xì)胞培養(yǎng)瓶底均勻鋪開，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至第3～4代時(shí)接種于6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%進(jìn)行干預(yù)。為了探究高磷誘導(dǎo)的VSMCs中SET8及細(xì)胞凋亡情況，將VSMCs隨機(jī)分為正常組和高磷組（10 mmol/L β-甘油磷酸），培養(yǎng)4 d，采用茜素紅染色檢測細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積，采用甲基麝香草酚藍(lán)比色法檢測鈣含量，采用流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡情況，采用Western blot和PCR檢測細(xì)胞內(nèi)SET8、p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白和mRNA的表達(dá)。為了探究SET8對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，將VSMCs隨機(jī)分為3組，對照組、空質(zhì)粒組（NS-shRNA）和SET8-shRNA組，SET8-shRNA組采用靶向敲低SET8基因的shRNA質(zhì)粒（濃度為2μg/L）轉(zhuǎn)染VSMCs。轉(zhuǎn)染48 h，提取細(xì)胞蛋白和mRNA，采用Western blot和PCR檢測細(xì)胞內(nèi)p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白和mRNA的表達(dá)水平。

1.3茜素紅染色 將VSMCs以5×104/孔接種于兩個12孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%，一個12孔板給予10 mmol/L β-甘油磷酸刺激，另一個12孔板給予轉(zhuǎn)染刺激培養(yǎng)4 d后，用茜素紅染液（pH=8.4，質(zhì)量濃度為0.1%）對細(xì)胞進(jìn)行鈣化染色，置于37℃溫箱中放置30 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)染色情況（鈣鹽沉積為橘紅色）并照相。

1.4鈣含量測定 取第3代VSMCs以5×104/孔密度接種于兩個12孔板中，一個12孔板給予10 mmol/L β-甘油磷酸刺激，另一個12孔板給予轉(zhuǎn)染刺激，細(xì)胞刺激4 d后棄上清液，用稀鹽酸脫鈣24 h，測定上清液中的鈣含量，并將脫鈣后的細(xì)胞用0.1%的SDS與0.1 mol/L NaOH的混合液溶解30 min，測定VSMCs中蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果用細(xì)胞鈣含量與蛋白質(zhì)含量的比值表示。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞接種于6孔板中，給予高磷刺激，4 d后用冷PBS液洗2遍，根據(jù)試劑說明書進(jìn)行PI/Annexin V雙重染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。經(jīng)PI/Annexin V雙重染色后可根據(jù)不同區(qū)域區(qū)分細(xì)胞：左下象限PI和Annexin V均為陰性，為活細(xì)胞；左上象限PI為陽性、Annexin V為陰性，為死亡細(xì)胞；右下象限PI為陰性、Annexin V為陽性，為早期凋亡細(xì)胞；右上象限PI為陽性、Annexin V為陽性，為晚期凋亡細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因的表達(dá) 收集各組細(xì)胞提取mRNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，RT-PCR檢測SET8、p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的表達(dá)，以GAPDH 作為內(nèi)參照。引物序列見表1。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5 min；變性95℃ 30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 40 s，循環(huán)35次；終末延伸72℃10 min。將產(chǎn)物電泳，收集圖像并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 收集各組細(xì)胞提取蛋白，配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，取50μg蛋白進(jìn)行上樣，恒壓95 V電泳1.5 h。之后選取PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜1 h，應(yīng)用TBST洗膜3次，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗稀釋液中（SET8 1∶500，p53 1∶1 000，Caspase3 1∶2 000，Bcl-2 1∶1 000，Bax 1∶2 000，GAPDH 1∶5 000），4℃孵育過夜，洗膜，放入二抗（稀釋比例1∶5 000）稀釋液中，37℃孵育1 h，洗膜后拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料呈正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1高磷對VSMCs鈣化的影響 茜素紅染色及鈣含量測定結(jié)果均顯示，高磷組鈣鹽沉積較正常組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 The expression of calcification in each group of VSMCs圖1 各組VSMCs鈣化的表達(dá)情況

2.2高磷對VSMCs凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，高磷組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Results of apoptosis in each group of VSMCs圖2 各組VSMCs凋亡結(jié)果

2.3高磷對VSMCs凋亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響 與正常組比較，高磷組SET8、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低，p53、Bax、Caspase3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.4干擾SET8對VSMCs鈣化的影響 茜素紅染色與鈣含量測定結(jié)果均顯示，與對照組和空質(zhì)粒組比較，SET8-shRNA組鈣鹽沉積顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

2.5干擾SET8基因后對凋亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響 與對照組和空質(zhì)粒組比較，SET8-shRNA組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低，p53、Bax、Caspase3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

3 討論

血管鈣化是心血管疾病死亡率增高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［4］。血管鈣化是由細(xì)胞介導(dǎo)的且高度可調(diào)的過程，其重要機(jī)制有細(xì)胞的凋亡、自噬、表型轉(zhuǎn)化等［5］。而VSMCs凋亡是血管鈣化發(fā)生的重要機(jī)制之一［6］。大量研究發(fā)現(xiàn)，高磷可誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生凋亡，是血管鈣化重要的危險(xiǎn)因素之一［7-8］。因此，尋找高磷因素誘導(dǎo)的血管鈣化的機(jī)制，對于臨床診治有重要價(jià)值。

研究表明高磷可促進(jìn)VSMCs轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予高磷刺激后，橘紅色鈣結(jié)節(jié)明顯增多，鈣含量也明顯增多，表明高磷促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示，高磷組細(xì)胞凋亡率明顯升高，提示高磷誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生了凋亡。高磷組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯降低，p53、Bax、Caspase3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量明顯升高，顯示高磷通過調(diào)控p53信號通路，抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax、Caspase3的表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控VSMCs的鈣化。高磷組SET8表達(dá)水平降低，提示SET8可能參與了高磷導(dǎo)致的血管鈣化。

Fig.3 The expressions of mRNA and protein in each group of VSMCs圖3 各組VSMCs mRNA和蛋白的表達(dá)

Fig.4 Effects of interfering SET8 on calcification of VSMCs圖4 干擾SET8對VSMCs鈣化的影響

Fig.5 The expression levels of mRNA and protein of p53,Bcl-2,Bax and Caspaste3 in each group of VSMCs圖5 各組VSMCs p53、Bcl-2、Bax、Caspase3mRNA和蛋白的表達(dá)

SET8是唯一能夠特異性催化H4K20單甲基化的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，同時(shí)也可甲基化p53、TWIST、Wnt等非組蛋白，并參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程［10］。有研究顯示干擾SET8表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及凋亡［11-12］。抑癌基因p53是SET8最重要的非組蛋白底物，能夠調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡［13］。SET8可以特異性單甲基化p53的382賴氨酸位點(diǎn)（p53K382me1），抑制p53靶基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯［14］。Bcl-2和Bax是正負(fù)凋亡調(diào)節(jié)因子，Bcl-2起抗凋亡作用，Bax起促進(jìn)凋亡作用。Bax的啟動子中存在p53的結(jié)合位點(diǎn)，p53能促進(jìn)Bax的表達(dá)，而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］。Bcl-2能夠抑制Caspase3的活性，而減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制血管鈣化［16］。本研究結(jié)果顯示，干擾 SET8后 Bcl-2表達(dá)下調(diào)，p53、Bax、Caspase3表達(dá)上調(diào)，提示高磷可能通過下調(diào)SET8表達(dá)，調(diào)控p53/Bcl-2/caspase信號通路，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達(dá)，從而參與調(diào)控VSMCs的鈣化和凋亡。