高宏濤 楊建玲 朱澤 陳云建

（昆藥集團(tuán)股份有限公司 云南 昆明 650106）

鹽酸法舒地爾是由日本旭化成株式會(huì)社研制開(kāi)發(fā)，是一種異喹啉磺胺衍生物[1]，也是一種蛋白激酶抑制劑。鹽酸法舒地爾不僅對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣有較強(qiáng)的抗痙攣?zhàn)饔?，?duì)缺血腦組織也有一定的保護(hù)作用，所以鹽酸法舒地爾現(xiàn)已成為改善及預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后的腦血管痙攣及隨之引起的腦缺血癥狀的首選藥物。

根據(jù)處方、生產(chǎn)工藝及質(zhì)量研究的相關(guān)文獻(xiàn)資料顯示［2-8]，鹽酸法舒地爾的有關(guān)物質(zhì)來(lái)源主要為工藝雜質(zhì)、副產(chǎn)物和降解雜質(zhì)。目前主要對(duì)異喹啉－5－磺酸、異喹啉、法舒地爾二聚體、N－氧化物、高哌嗪等已知雜質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)質(zhì)量研究和控制。

鹽酸法舒地爾的起始物料為5-異喹啉磺酸[1]，該起始物料中可能含有磺化異喹啉雜質(zhì)；導(dǎo)致在合成鹽酸法舒地爾的過(guò)程中，產(chǎn)生磺化異構(gòu)體的衍生物，即法舒地爾的異構(gòu)體雜質(zhì)。

目前鹽酸法舒地爾注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收錄異構(gòu)體雜質(zhì)的質(zhì)控方法，而國(guó)內(nèi)僅研究了鹽酸法舒地爾原料中一種異構(gòu)體的檢測(cè)方法[9]。

本研究通過(guò)建立一種有效可行的HPLC法對(duì)鹽酸法舒地爾注射液中的2種異構(gòu)體雜質(zhì)（1位異構(gòu)體衍生物和8位異構(gòu)體衍生物）的含量進(jìn)行測(cè)定，為更好地控制鹽酸法舒地爾注射液的質(zhì)量提供依據(jù)。

鹽酸法舒地爾及其異構(gòu)體雜質(zhì)的化合物結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 化合物結(jié)構(gòu)式

1.儀器及試藥

SHIMAZDU LC20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；XPE26電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FE20型pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）鹽酸法舒地爾注射液（昆藥集團(tuán)股份有限公司）；鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體對(duì)照品（深圳博爾特公司，含量97.81%）；鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體對(duì)照品（深圳博爾特公司，含量97.61%）；乙腈和三乙胺為色譜純；磷酸為分析純；水為自制雙蒸水。

2.方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑的YMC-Pack Pro C18色譜柱（4.6×250mm,5μm），以1.5%三乙胺pH5.4：乙腈=87∶13為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，流速：1.0ml/min，柱溫：30℃

檢測(cè)波長(zhǎng)：275nm，進(jìn)樣量：20μl，稀釋劑：1.5%三乙胺pH5.4：乙腈=85∶15，按下表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液配制

2.2.1 1.5%三乙胺pH5.4：精密移取15ml三乙胺至985ml水中，用磷酸調(diào)pH至5.4，用0.22μm的水膜抽濾。

2.2.2 1.5%TEA (pH5.4)/乙腈（87/13,V/V）：量取1.5%三乙胺（pH5.4）溶液870ml與乙腈130ml，混勻。

2.2.3 稀釋劑（空白溶劑）：量取850ml 1.5%三乙胺（pH5.4）與150ml乙腈，混勻。

2.2.4 空白輔料溶液：取氯化鈉15mg，精密稱定，置50ml量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋至刻度，搖勻，作為空白輔料溶液。

2.2.5 異構(gòu)體雜質(zhì)儲(chǔ)備液（5μg/ml）：分別取異構(gòu)體雜質(zhì)1與異構(gòu)體雜質(zhì)2對(duì)照品各5mg，精密稱定，置100ml量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋至刻度，搖勻；精密移取5ml，置50ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)儲(chǔ)備液。

2.2.6 對(duì)照品溶液（0.005mg/ml）：取鹽酸法舒地爾對(duì)照品5mg，精密稱定，置10ml量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋至刻度，搖勻；精密移取1.0ml，置100ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.7 供試品溶液（0.48mg/ml）：取鹽酸法舒地爾注射液10支并混勻，精密移取10ml置25ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻；精密移取2ml置25ml量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取空白溶劑、空白輔料溶液、異構(gòu)體雜質(zhì)儲(chǔ)備液和對(duì)照品溶液各20μl，照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖(見(jiàn)圖2)，鹽酸法舒地爾峰與相鄰雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰間均能良好分離，空白溶劑色譜圖在各雜質(zhì)以及主峰保留時(shí)間處無(wú)干擾，專屬性溶液中主峰與相鄰雜質(zhì)以及各雜質(zhì)之間分離度符合要求。本方法的專屬性良好。

圖2 專屬性HPLC色譜圖

2.4 線性和范圍

分別取鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體雜質(zhì)和鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體雜質(zhì)對(duì)照品各5mg，加稀釋劑溶解稀釋成各雜質(zhì)濃度為0.25、0.41、0.51、0.76、1.01和1.521的異構(gòu)體雜質(zhì)系列溶液，分別精密量取上述溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以相應(yīng)對(duì)照品的濃度(C)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

結(jié)果顯示：鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體在0.2539μg/ml～5.0780μg/ml濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.1583 x+0.0044，相關(guān)系數(shù)r為0.9998；鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體在0.2227μg/ml～1.3360μg/ml濃度范圍內(nèi)關(guān)系良好，線性的線性方程為y=14669.9311x- 63.7465，相關(guān)系數(shù)r為0.9999。

2.5 定量限與檢測(cè)限

在選定的色譜條件下，分別取鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體和鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，按信噪比3∶1和10∶1分別確定檢出限和定量限。

結(jié)果顯示：鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體的定量限濃度為0.4062μg/ml，相對(duì)應(yīng)的百分比含量為0.081%，檢測(cè)限濃度為0.1270μg/ml，相對(duì)應(yīng)的百分比含量為0.025%；鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的定量限濃度為0.2227μg/ml，相對(duì)應(yīng)的百分比含量為0.045%，檢測(cè)限濃度為0.1114μg/ml，相對(duì)應(yīng)的百分比含量為0.022%。

2.6 準(zhǔn)確度

精密移取8.0ml鹽酸法舒地爾注射液，置25ml量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋至刻度，搖勻，作為供試品儲(chǔ)備液。按2.2.5項(xiàng)下雜質(zhì)儲(chǔ)備液配制方法配制雜質(zhì)儲(chǔ)備液，精密移取5.0ml，置50ml容量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為準(zhǔn)確度雜質(zhì)儲(chǔ)備液。照限度水平為0.05%、0.2%以及0.3%的各準(zhǔn)確度溶液，每個(gè)濃度水平配制3份，精密量取空白供試品溶液以及各準(zhǔn)確度溶液20μl，按要求注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，并計(jì)算回收率。

結(jié)果顯示：鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體的單個(gè)回收率在93.21%～102.13%；9份溶液的平均回收率為98.30%，RSD為3.29%。鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的單個(gè)回收率在93.5%～102.6%；9份溶液的平均回收率為99.5%，RSD為4.0%。表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.7 精密度

2.7.1 重復(fù)性 照2.2.5項(xiàng)下配制方法配制0.2%濃度水平加標(biāo)溶液，平行配制6份。取空白供試品溶液以及各加標(biāo)溶液20μl按要求分別注入高校液相色譜儀，記錄色譜圖，并計(jì)算每份溶液的回收率以及RSD。結(jié)果顯示：鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體的回收率的RSD為3.0%；鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的回收率的RSD為2.1%。

2.7.2 中間精密度 在不同天、不同的分析人員、不同的液相系統(tǒng)，按重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的方法制備空白供試品溶液以及0.2%濃度水平加標(biāo)溶液進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算每份溶液的回收率及RSD。

結(jié)果顯示：鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體的回收率的RSD為3.63%。鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的回收率的RSD為2.4%。表明本方法具有較好的精密度。

2.8 溶液穩(wěn)定性

取“重復(fù)性”下0.2%濃度水平的加標(biāo)溶液分別置于室溫和冰箱（約5℃）中，精密量取上述溶液各20μl，分別于不同時(shí)間注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)果顯示：與0小時(shí)相比，加標(biāo)樣品溶液在室溫條件下放置9小時(shí)，鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體的最大絕對(duì)差值為0.01%，鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的絕對(duì)差值為0.01%；與0小時(shí)比較，加標(biāo)樣品溶液在5℃條件下放置2天，鹽酸法舒地爾1位異構(gòu)體的最大絕對(duì)差值為0.02%，鹽酸法舒地爾8位異構(gòu)體的絕對(duì)差值為0.00%。加標(biāo)樣品溶液在5℃條件下2天內(nèi)穩(wěn)定，加標(biāo)樣品溶液在室溫條件下24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性

取“重復(fù)性”項(xiàng)下方法配制加標(biāo)供試品溶液。改變色譜條件，測(cè)定供試品有關(guān)物質(zhì)的量，見(jiàn)表2。

表2 方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論：異構(gòu)體雜質(zhì)的絕對(duì)差值均小于0.1%，該方法在檢測(cè)波長(zhǎng)273nm～277nm范圍內(nèi)，柱溫在30℃～35℃范圍內(nèi)，流動(dòng)相pH在5.3～5.5范圍內(nèi)，方法耐用性良好。

2.10 樣品的檢測(cè)

按“2.2”配制雜質(zhì)對(duì)照溶液與3批供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算鹽酸法舒地爾原料中異構(gòu)體的含量。結(jié)果3個(gè)批號(hào)(批號(hào)：17EC01、17EC02、17EC03)注射劑樣品的異構(gòu)體含量均未檢出。

3.討論

本試驗(yàn)研究的鹽酸法舒異構(gòu)體為原料起始原料中引入的異構(gòu)體衍生物，為鹽酸法舒地爾的非對(duì)映異構(gòu)體。由于該異構(gòu)體雜質(zhì)毒性數(shù)據(jù)未知，且本制劑為注射劑，必須嚴(yán)格控制原料中該雜質(zhì)的含量，從而保證臨床用藥的安全性。

通過(guò)對(duì)方法的專屬性、線性與范圍、檢測(cè)限與定量限、準(zhǔn)確度，精密度、耐用性、溶液穩(wěn)定性的方法學(xué)研究，表明方法可用于鹽酸法舒地爾注射液中異構(gòu)體雜質(zhì)含量的檢測(cè)。