付開聰1 崔明筠1* 羅 健1 付麗紅2 倪 凱 高 敏
1.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南 普洱 665000;2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;3.云南省中醫(yī)中藥研究院,云南 昆明 650000
腰椎間盤突出癥是指腰椎間盤在受外力作用下,髓核從破裂處脫出,壓迫腰椎的神經(jīng)根,從而引起腰痛、下肢放射性疼痛和皮膚麻木、發(fā)涼、皮溫下降、小便刺痛等一系列臨床癥狀,該病在人群中較為常見,由于缺少有效的治療方法,一旦患上,將嚴(yán)重影響患者的正常生活[1-2]。為尋求有效的治療方法,普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所從哈尼族民間挖掘到一劑特效驗(yàn)方,后經(jīng)普洱市民族醫(yī)院研究開發(fā)成院內(nèi)制劑銅錘白花膠囊,該制劑經(jīng)臨床驗(yàn)證對腰椎間盤突出癥及腰腿疼痛的病癥具有特殊功效[3]。
處方主要由民族藥小銅錘、白花丹和中藥細(xì)辛、三七、蜈蚣、蝎子等19味藥材組成,19味藥材君臣佐使搭配合理,相輔相成,增強(qiáng)療效,起到了療傷、止痛、疏通經(jīng)絡(luò)的作用。方中含有細(xì)辛、蜈蚣、全蝎和土鱉蟲等4味毒性藥材,該民族醫(yī)藥處方在普洱市民族醫(yī)院臨床使用超過5年,先后收集到125份臨床觀察病例,患者未出現(xiàn)過臨床不良反應(yīng),為進(jìn)一步探究銅錘白花膠囊的安全性,普洱市民族醫(yī)院聯(lián)合云南省中醫(yī)中藥研究院,開展了銅錘白花膠囊對大鼠的長期毒性實(shí)驗(yàn)研究,為民族醫(yī)藥制劑銅錘白花膠囊臨床安全應(yīng)用,提供了參考依據(jù)。
1.1 儀器 SQP型電子分析天平(德國賽多利斯);小鼠灌胃器[東西儀(北京)科技有限公司];RM2235切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);SYSMEX XT-1800i全自動動物血液分析儀(日本希森美康公司);Qlympus Au5400全自動生化分析儀(日本奧林巴斯有限公司)。
1.2 材料 銅錘白花膠囊,每粒裝0.45 g(普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,1次5粒,1日3次,日服用量為13.65 g;飲用水(昆明珍茗食品有限責(zé)任公司);試劑盒(南京建成生物工程研究所);鼠料和玉米芯墊料(蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動物飼料科技有限公司)。
1.3 動物體重范圍 60~80 g 的SPF級大鼠162只,雌雄各半,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。
2.1 動物分組和給藥 采用分層分組法,對162只大鼠,隨機(jī)分為飲用水對照組、銅錘白花膠囊低(3g·kg-1·d-1)、中(6g·kg-1·d-1)、高(12g·kg-1·d-1)劑量組共4組,除對照組30只外,銅錘白花膠囊組每組44只,雌雄各半。連續(xù)灌胃銅錘白花膠囊3個月,依照雌雄各半,第13周隨機(jī)抽取20只對照組大鼠,銅錘白花膠囊給藥組大鼠每組抽取26只,實(shí)施剖檢。
2.2 觀察指標(biāo)
2.2.1 一般情況 每天觀察對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠的一般狀態(tài),每周1次體重和耗料量測定,停藥4周后剖檢剩余動物。觀察銅錘白花膠囊給藥期間和給藥后恢復(fù)期大鼠的毒性反應(yīng),每周稱量1次大鼠體重和平均進(jìn)食量,每只動物每周攝食量以平均值記。
2.2.2 血液檢查 給藥結(jié)束后和恢復(fù)期結(jié)束,測定對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠的血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞平均體積、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度、血小板數(shù)及白細(xì)胞計數(shù)等指標(biāo)。
2.2.3 血液生化指標(biāo) 給藥結(jié)束后和恢復(fù)期結(jié)束,測定對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、總膽紅素等肝功指標(biāo),尿素等腎功指標(biāo),葡萄糖膽固醇等生化指標(biāo)。
2.2.4 病理學(xué)檢查 給藥結(jié)束后和恢復(fù)期結(jié)束,剖檢對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠,觀察雌雄大鼠的肝肺腎等主要器官的濕重,計算臟器系數(shù);并用10%中性福爾馬林液對大鼠臟器做固定處理,再對其進(jìn)行石蠟包埋切片,鏡檢。
2.2.5 數(shù)據(jù)處理方法 數(shù)據(jù)用SPSS軟件16.0處理,計量資料符合正態(tài)分布,方差齊者采用T檢驗(yàn),方差不齊采用T′檢驗(yàn);計量資料不符合正態(tài)分布,采用秩和檢驗(yàn),各組與對照組進(jìn)行比較,P<0.05表示數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 對一般情況的影響 實(shí)驗(yàn)期間,對照組和銅錘白花膠囊給藥組大鼠未監(jiān)測到大鼠異常行為,精神狀態(tài)和飲食活動正常。給藥結(jié)束與恢復(fù)期結(jié)束,銅銅錘白花膠囊組進(jìn)食量與飲用水空白對照組比較,進(jìn)食量稍微減少,但不存在顯著性差異(P>0.05)屬于正常范疇,見表1。錘白花膠囊低、中、高劑量組雌雄動物體重與對照組比較出現(xiàn)動物體重增長緩慢,但在恢復(fù)期攝食量和體重增長恢復(fù)正常。見表2。
表1 給藥對SD大鼠進(jìn)食的影響 (g)
注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01。
時間性別對照組低劑量組中劑量組高劑量組13 周雌282.35±22.06263.53±20.21*260.61±16.72**254.81±18.48**雄478.71±32.36456.94±33.44429.39±43.83**424.53±34.35**17周雌300.64±22.98286.37±23.04 278.20±14.68 263.37±15.53**雄522.94±45.33497.39±23.76479.41±57.46462.93±32.49*
注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01。
3.2 血液學(xué)檢查 由表3可知,灌胃13周結(jié)束時,銅錘白花膠囊組大鼠白細(xì)胞、血紅蛋白計數(shù)和活化部分凝血活酶時間,與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05);其余銅錘白花組血液學(xué)檢查指標(biāo)和對照組比較可見統(tǒng)計學(xué)意義的增加或減少,銅錘白花膠囊劑量組大鼠的血液學(xué)指標(biāo),未見明顯劑量時間依賴關(guān)系,綜合上述結(jié)果,故認(rèn)為是由動物個體差異所致[4-5];恢復(fù)期結(jié)束,各劑量組動物血液學(xué)指標(biāo)與對照組比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。因此連續(xù)灌胃給予銅錘白花膠囊不會影響大鼠的血液學(xué)指標(biāo)。
3.3 血清生化學(xué)檢查 由表4可知,灌胃13周結(jié)束時,銅錘白花膠囊組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血糖、尿素、肌酐、與空白對照組比較不存在顯著性差異,無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05);銅錘白花膠囊組大鼠總膽紅素、總蛋白、總膽固醇值和和空白對照組比較可見統(tǒng)計學(xué)意義的增加或降低;恢復(fù)期結(jié)束,錘白花膠囊組大鼠總膽紅素、總蛋白、總膽固醇值和空白對照組比較未見顯著性增加或降低,大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)和銅錘白花膠囊灌胃劑量未形成明顯量效關(guān)系,考慮認(rèn)為是由動物個體差異所致出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異,未構(gòu)成毒理學(xué)意義,說明指標(biāo)的變化不是由藥物毒性反應(yīng)引起的[6-7]。
項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組白細(xì)胞計數(shù)/109/L13周5.17±3.076.75±2.466.86±2.856.77±2.3017周7.09±3.227.14±3.216.68±3.205.43±1.68淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)/%13周64.86±15.8767.33±6.72 69.25±17.2769.98±6.12 17周67.15±8.15 65.39±9.12 65.94±6.78 64.22±8.50 淋巴細(xì)胞計數(shù) /109/L13周3.47±2.474.48±1.46 4.87±2.13*4.80±1.8317周4.67±2.054.62±2.354.44±2.263.50±1.21紅細(xì)胞計數(shù)/109/L13周7.61±0.82 7.12±0.55*7.65±0.63 7.17±0.54*17周7.84±1.568.14±1.017.84±0.657.71±0.81血紅蛋白/g/L13周136.45±26.92 132.77±10.25 141.38±10.94 134.15±8.63 17周143.50±25.84 147.00±15.14 146.35±10.75 142.76±13.25 血小板總數(shù)/109/L13周631.15±254.04 815.73±133.29**727.50±170.20742.88±146.3117周906.08±218.14882.31±271.21807.18±294.63762.00±325.05凝血酶原時間/s13周13.1±3.4612.36±2.32 15.31±3.46*12.89±3.00 17周15.4±4.0212.39±2.28*13.35±3.3813.65±3.56活化部分凝血活酶時間/s13周23.11±3.04 24.20±2.3 25.04±3.84 21.80±1.46 17周24.83±2.5125.59±3.1925.37±2.6823.46±2.36
注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01。
項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組總膽紅素/umol/L13周0.73±0.401.03±0.34*0.97±0.37*0.68±0.3117周2.05±0.631.58±0.39*1.62±0.491.69±0.30總蛋白/g/L13周71.69±2.92 67.95±5.55**70.39±4.00 69.53±4.60 17周72.66±4.5672.27±5.0269.89±5.8973.22±5.80 谷丙轉(zhuǎn)氨酶/ U/L13周43.55±9.62 42.77±10.52 39.23±6.96 53.38±35.5917周61.70±24.2854.56±16.67 54.24±22.98 49.82±14.34谷草轉(zhuǎn)氨酶/U/L13周169.00±50.76 136.62±39.73* 145.19±37.45 165.85±77.82 17周198.40±158.78216.00±155.43 183.24±119.80 201.76±102.03血糖/mmol/L13周4.96±0.815.14±0.53 5.24±0.82 5.23±0.5217周5.61±1.005.28±0.675.35±0.545.25±0.59尿素/umol/L13周7.22±1.747.18±2.11 6.78±1.63 7.71±2.0217周7.33±0.976.90±1.507.10±1.766.44±1.15肌酐/umol/L13周27.95±12.1822.96±13.24 25.19±9.04 23.23±11.3517周22.20±8.80 20.63±4.81 21.18±6.74 16.24±5.01
續(xù)表4
項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組總膽固醇/mmol/L13周2.16±0.372.01±0.49 2.04±0.27 1.76±0.34**17周1.95±0.282.06±0.34 1.91±0.54 1.92±0.43肌酸激酶/umol/L13周4429.45±3013.74 2617.19±1918.04*3023.27±2417.33 3167.27±2153.2617周2502.10±1785.663793.94±3851.173331.76±2984.444159.35±3569.23
注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01。
3.4 臟器系數(shù)和臟器病理組織學(xué)檢查 給藥結(jié)束后和恢復(fù)期結(jié)束胃、腦、十二指腸、骨骼肌、睪丸、附睪、子宮、卵巢、前列腺、腎上腺、甲狀腺、食管、主動脈、膀胱、胸腺、皮膚、骨髓、脊髓、氣管、心、脾、腸系膜淋巴等器官組織未觀察到與受試物有關(guān)的改變。
項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組胸腺13周0.102±0.0280.124±0.0310.124±0.0250.107±0.01817周0.106±0.0280.095±0.020.090±0.0250.103±0.048腎上腺13周0.026±0.0030.028±0.0180.025±0.0040.024±0.00617周0.024±0.0040.025±0.0060.026±0.0030.024±0.005子宮13周0.209±0.0460.296±0.082**0.273±0.054** 0.318±0.073**17周0.260±0.0410.317±0.0980.324±0.0940.359±0.139卵巢13周0.049±0.0090.052±0.0080.055±0.0090.085±0.12317周0.055±0.0080.077±0.0750.052±0.0100.053±0.012心13周 0.32±0.0330.346±0.0270.339±0.032 0.360±0.030**17周0.364±0.0590.344±0.0410.340±0.0270.365±0.039肝13周2.588±0.1773.121±0.278**3.164±0.220** 3.338±0.207**17周2.745±0.2873.109±0.273*2.913±0.2052.957±0.216脾13周0.188±0.0190.211±0.028*0.200±0.0230.207±0.02517周0.239±0.0620.195±0.0310.196±0.0140.207±0.029腎13周0.630±0.0460.702±0.042*0.737±0.095** 0.717±0.037**17周0.669±0.0340.670±0.0420.663±0.0320.688±0.049腦13周0.734±0.0600.774±0.0530.774±0.0640.763±0.06517周0.713±0.0500.701±0.1070.733±0.0580.748±0.027
注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01。
項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組胸腺13周0.090±0.0170.079±0.0160.084±0.024 0.071±0.017*17周0.064±0.0090.074±0.0170.067±0.0160.079±0.025腎上腺13周0.015±0.0030.014±0.0020.014±0.0020.015±0.00317周0.013±0.0010.014±0.0030.013±0.0030.014±0.002睪丸13周0.750±0.0770.694±0.1610.845±0.069**0.786±0.22717周0.735±0.0860.784±0.0580.787±0.0700.822±0.061附睪13周0.319±0.0260.293±0.0550.341±0.0530.274±0.08117周0.355±0.0480.339±0.0300.339±0.0590.351±0.071
續(xù)表6
項目時間對照組低劑量組中劑量組高劑量組心13周0.335±0.021 0.313±0.028*0.359±0.0350.328±0.03017周0.316±0.0560.375±0.1190.314±0.0400.335±0.034肝13周 2.579±0.272 2.863±0.230* 3.007±0.166** 3.124±0.306**17周 2.724±0.175 2.724±0.331 2.810±0.2282.980±0.361脾13周 0.174±0.034 0.160±0.014 0.156±0.0170.162±0.01417周 0.146±0.023 0.149±0.024 0.156±0.020.160±0.034腎13周 0.617±0.072 0.704±0.065** 0.750±0.064**0.708±0.17517周0.0595±0.047 0.636±0.048 0.675±0.057* 0.705±0.04**腦13周 0.440±0.060 0.458±0.048 0.509±0.058 0.516±0.082*17周 0.411±0.034 0.425±0.043 0.450±0.0700.447±0.015*
注:與空白對照組比較,*P<0.05;**P<0.01。
由表5~6的數(shù)據(jù)分析,結(jié)合對照組和銅錘白花膠囊組大鼠器官濕重、體重、病理結(jié)果和臟體比系數(shù)的變化進(jìn)行分析,給藥結(jié)束時,與對照組比較,銅錘白花膠囊組大鼠臟體比系數(shù)均增加或降低的生物學(xué)意義較大,但缺少劑量和時間依賴性,且器官組織未觀察到與受試物有關(guān)的改變,說明臟器指標(biāo)的變化可能不是藥物特異性毒性損傷;恢復(fù)期結(jié)束,雌性大鼠臟體比系數(shù)無明顯變化,雄性大鼠肝腦腎臟體比系數(shù)升高,結(jié)合大鼠尿液檢查、病理組織檢查,可視為不是毒性靶器官[8]。
長期毒性試驗(yàn)是藥物臨床前安全性評價采取的主要研究方法,文中研究試驗(yàn),通過將銅錘白花膠囊按照臨床用藥途徑大劑量重復(fù)多次給予動物,密切檢測動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和中毒靶組織器官,獲得毒性產(chǎn)生的量效和時效關(guān)系,預(yù)測了銅錘白花膠囊在臨床上可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)性質(zhì)及發(fā)生率,對銅錘白花膠囊的臨床應(yīng)用具有重要的參考意義。
銅錘白花膠囊對大鼠長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給藥期與恢復(fù)期結(jié)束時,銅錘白花膠囊低、中、高劑量組大鼠一般狀況良好,其活動,飲食,飲水正常,與對照組比較體重部分時期增長緩慢,但在恢復(fù)期攝食量和體重增長恢復(fù)正常,其它各項臨床檢驗(yàn)未見與銅錘白花膠囊灌胃劑量形成明顯量效關(guān)系,且銅錘白花膠囊組大鼠各器官組織均未觀察到與給藥明顯相關(guān)的組織形態(tài)學(xué)改變,綜合以上研究數(shù)據(jù)說明在長期毒性實(shí)驗(yàn)條件下,銅錘白花膠囊對大鼠是安全的,為民族藥銅錘白花膠囊的臨床應(yīng)用提供了安全性評價依據(jù)。