查桂平　汪卓瓊

[摘要] 目的 研究毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞株增殖和凋亡的影響，以及探索潛在的信號通路。 方法 采用MTT比色法檢測毛蘭素對MUM-2B和C918葡萄膜黑色素瘤細胞株增殖活力的影響，DAPI染色結合AnnexinV/PI 雙染后流式細胞分析檢測葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡率，免疫印跡分析細胞增殖相關蛋白如p21、MAPK及其磷酸化形式，凋亡相關蛋白Caspase-3和PARP等的表達量。 結果 毛蘭素對C918、MUM-2B葡萄膜黑色素瘤細胞均存在不同程度的抑制作用。當濃度達到25 μmol/L時，MUM-2B 的抑制率達到（79.92±2.79）%，C918的抑制率在（84.60±0.81）%。DAPI染色可見細胞數(shù)量隨毛蘭素濃度增加而逐漸減少，而且存在細胞凋亡現(xiàn)象。隨著毛蘭素作用濃度的增大，G2/M期細胞的比例逐漸增加，早期和晚期凋亡細胞比例增加。在毛蘭素處理后，p38 MAPK蛋白表達在MUM-2B中較為顯著的下調(diào)，PARP總蛋白水平有顯著下調(diào)（P<0.05），p38 MAPK總蛋白有一定程度的下調(diào)，而p21、PARP活化形式（cl-PARP）和Caspase-3的活化形式（cl-Caspase3）顯著上調(diào)（P<0.05）。 結論 毛蘭素能夠有效抑制葡萄膜黑色素瘤細胞C918、MUM-2B、增殖，阻滯細胞周期，促進葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡，且其作用效果呈現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的劑量依賴性。其作用機制與上調(diào)p21表達，抑制p38 MAPK表達有關，后者可削弱MAPK信號通路活化，并可活化細胞凋亡途徑關鍵蛋白Caspase-3誘導凋亡。

[關鍵詞] 毛蘭素;p21;MAPK途徑;葡萄膜黑色素瘤;細胞凋亡

[中圖分類號] R739.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）22-0031-04

[Abstract] Objective To study the effects of erianin on proliferation and apoptosis of uveal melanoma cell lines and to explore potential signaling pathways. Methods MTT colorimetric assay was used to detect the effect of erianin on the proliferation of MUM-2B and C918 strains of uveal melanoma cell lines. After DAPI staining combined with AnnexinV/PI double staining， apoptotic rate of uveal melanoma cells was analyzed and detected by flow cytometry analysis. Western blot analysis was used to analyze cell proliferation-related proteins such as p21， MAPK and its phosphorylated form， expression amount of apoptosis-related proteins such as Caspase-3 and PARP. Results Erianin had different inhibitory effects on C918 and MUM-2B of uveal melanoma cells. When the concentration reached 25 μmol/L， the inhibition rate of MUM-2B was up to（79.92±2.79）%， and the inhibition rate of C918 was about（84.60±0.81）%. The number of cells visible in DAPI staining was decreased with the increase of the concentration of erianin， and there was apoptosis. As the concentration of erianin increased， the proportion of G2/M phase cells increased gradually， and the proportion of early and late apoptotic cells increased. After the treatment with erianin， among the two strains of cells， the expression of p38 MAPK protein was significantly down-regulated in MUM-2B， and the total protein level of PARP was significantly down-regulated （P<0.05）. The total protein of p38 MAPK was down-regulated to a certain extent， while p21， PARP-activated form （cl-PARP） and Caspase-3 activated form （cl-Caspase3） were significantly up-regulated（P<0.05）. Conclusion Erianin can effectively inhibit the proliferation of uveal melanoma cells C918， MUM-2B， arrest cell cycle， promote the apoptosis of uveal melanoma cells， and its effect is dose-dependent within a certain range. Its mechanism of action is related to up-regulation of p21 expression and inhibition of p38 MAPK expression. The latter can attenuate the activation of MAPK signaling pathway and activate the key protein Caspase-3 in the apoptosis pathway to induce apoptosis.

[Key words] Erianin; p21; MAPK pathways; Uveal melanoma; Apoptosis

眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤（Uveal melano-ma，UM）與結膜黑色素瘤（Choroidal melanoma，CM）[1]，其中UM是成人發(fā)生率最高的眼內(nèi)惡性腫瘤，起源于葡萄膜層，惡性程度高，極易發(fā)生早期轉移，預后差，死亡率高，嚴重威脅患者視力與生命。CM起病較為隱匿，早期不影響視力，發(fā)現(xiàn)時常有擴散轉移，嚴重影響患者生命安全。因此，研究眼部黑色素瘤發(fā)生機制，對探尋眼部黑色素瘤早期診斷和治療新靶點，提高治療有效性，降低眼球摘除率及轉移率，提高患者視覺預后及生存時間，具有十分重要的臨床指導和科學意義。目前，針對該腫瘤的治療主要為手術和放化療等非病因治療，缺乏針對其病因的治療手段。

從天然植物中獲得生物活性的天然產(chǎn)物是先導化合物發(fā)現(xiàn)的重要途徑，統(tǒng)計1981～2002年20年來美國FDA批準的抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)，有74%是來自于天然產(chǎn)物或者通過其衍生物得到，比較典型的如紫杉醇、鬼臼毒素、喜樹堿等。石斛是傳統(tǒng)中藥，為蘭科多年生草本植物。國內(nèi)外學者對石斛屬植物進行了大量的藥理學研究。研究表明石斛具有抗衰老、增強機體免疫力、擴張血管以及抗血小板凝集等多種效能，特別是其抗腫瘤活性日益受到廣泛關注[2]。有研究表明石斛能夠通過下調(diào)ERK通路從而抑制肺癌細胞的增殖，另一方面，還能夠促進肺癌細胞對失巢凋亡的敏感性[3]。在其他腫瘤中，石斛及其從中提取的活性物質(zhì)表現(xiàn)出促癌細胞凋亡以及轉移的現(xiàn)象，包括前列腺癌[4]、白血病[5]、乳腺癌[6]、骨肉瘤[7]等。毛蘭素是石斛的活性化合物之一，屬聯(lián)芐類化合物，化學名為2-甲氧基-5-[2-（3，4，5-三甲氧基-苯基）-乙基]-苯酚，已有研究表明該化合物具有抗腫瘤活性，并可抑制視網(wǎng)膜血管新生[8]，但對其具體的分子機制及藥物靶標卻未能明確。另一方面，毛蘭素對人葡萄膜黑色素瘤細胞的抗癌活性也鮮有報道。因此，本文旨在通過體外研究毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡與周期的影響，并探討其可能的抗癌分子機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞和抗體

人葡萄膜黑色素瘤細胞株MUM-2B及C918均購自浙江如耀生物科技有限公司，F(xiàn)BS及RPMI1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司;細胞培養(yǎng)用PBS與雙抗購自北京索萊寶生物科技有限公司;細胞培養(yǎng)所需耗材均購自美國Coring公司;MTT購自美國Amresco公司;DAPI染料購自Invitrogen公司;Annexin-FITC/PI流式檢測試劑盒購自美國BD公司;免疫印跡所用抗體均購自CST公司，抗人Caspase-3抗體（貨號9662，稀釋比1∶1000），cleaved Caspase-3抗體（貨號9664，稀釋比1∶1000），PARP抗體（貨號9542，稀釋比1∶1000），以及cleaved-PARP抗體（貨號9541，稀釋比1∶1000），p38 MAPK抗體（貨號8690，稀釋比1∶1000），GAPDH（貨號AB-P-R001，稀釋比1∶1000）及HRP偶聯(lián)的羊抗兔/鼠IgG等抗體購自Cell Signaling Technology公司，稀釋比例為1∶1000（二抗1∶3000），流式檢測周期與凋亡試劑盒購自美國BD公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 MTT法檢測細胞增殖

采用MTT比色法檢測毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖的影響。將細胞制成單細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加毛蘭素（以加等量不含藥培養(yǎng)基為對照組），孵育48 h，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）15 μL，孵育4 h后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，檢測波長562 nm，參比波長630 nm，測定吸光值，以不加藥的培養(yǎng)基作為對照，計算毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞的抑制率。

1.3 細胞核形態(tài)檢測（DAPI染色）

C918和MUM-2B細胞鋪板到10 cm，dish中，事先已放入入已滅菌的干凈的蓋玻片，做細胞爬片，用毛蘭素處理24 h后，分別取出蓋玻片置于6 cm dish中，PBS洗滌1～2遍，加入1 mL甲醇固定30 s，棄掉甲醇后，加入DAPI染液使其工作濃度為1 μg/mL，染色2～3 min，棄去DAPI染色液，加入適量PBS，洗3遍，立即置于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)特征，激發(fā)波長為360～400 nm。

1.4 細胞凋亡檢測

采用Annexin-FITC/PI流式檢測試劑盒檢測毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡的影響。將MUM-2B和C918細胞分組加毛蘭素處理24 h后，胰酶消化，計數(shù)，取5×106 cells于1.5 mLEP管中，2000 rpm離心5 min，棄上清后加入預冷的PBS，2000 rpm離心5 min，棄上清，加入300 μL 1×BD Buffer重懸細胞，避光加入5 μL FITC，室溫避光15 min，后加入5 μL PI，室溫避光8 min，最后加入200 μL 1×BD Buffer混勻，上流式細胞儀中檢測。

1.5 Western-blotting分析

收集毛蘭素及陰性對照組處理24 h 后的C918和MUM-2B細胞，棄去培養(yǎng)基，預冷PBS洗滌2遍，加入150 μL 2×loading buffer裂解細胞至細胞呈黏稠狀，1 mL注射器吹打使DNA斷裂，隨后于100℃處理10 min?？偟鞍捉?jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉移至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，加入一抗，4℃ 孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜 3 次后，通過 ECL 試劑盒進行顯影檢測。Image J分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白表達的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較用t檢驗，多組間差異采用One-way ANOVA和Newman-Keuls-test多重比較t檢驗分析。雙側P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞增殖的影響

選擇2株不同的葡萄膜黑色素瘤細胞，分別在3.125、6.250、12.500、25.000 μmol/L毛蘭素作用48 h后，進行MTT測試，考察毛蘭素對細胞增殖的影響，見表1。毛蘭素對2株葡萄膜黑色素瘤細胞有不同程度的抑制，25 μmol/L毛蘭素作用下MUM-2B抑制率達到（79.92±2.79）%，相同濃度下C918的抑制率（84.60±0.81）%。在一定濃度范圍內(nèi)，毛蘭素對2株葡萄膜黑色素瘤細胞的抑制率隨濃度增加而提高，兩組抑制率比較發(fā)現(xiàn)，毛蘭素濃度在0、0.390、1.560、12.500以及25.000 μM時，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞核形態(tài)的影響

根據(jù)DAPI染色結果發(fā)現(xiàn)，未加毛蘭素處理的對照組細胞核較完整，未見明顯凋亡形態(tài)。毛蘭素處理后細胞數(shù)量明顯減少，且細胞數(shù)量隨濃度增加而逐漸減少，同時高倍鏡下可見部分細胞呈典型凋亡形態(tài)，提示毛蘭素中存在可誘導細胞凋亡的組分，且隨著濃度的增加，凋亡的細胞增多。見封三圖1。

2.3 毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞周期的影響

MUM-2B和C918細胞周期的結果顯示，在毛蘭素作用下，兩株細胞G2/M期細胞比例均有明顯增加，且隨著毛蘭素作用濃度的增加，G2/M期的細胞比例逐漸增加，同時S期和G0/G1期的細胞比例降低，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明毛蘭素可能通過將細胞阻滯在G2/M期，從而誘導細胞凋亡（封三圖2A）。當毛蘭素作用濃度達到20 μmol/L時，MUM-2B細胞G2/M期比例由對照組時的19.03%增加至25.46%，C918細胞G2/M期比例由22.51%增加至29.83%（封三圖2B）。

2.4 毛蘭素對葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡的影響

毛蘭素處理24 h后，MUM-2B和C918細胞進行Annexin V/PI雙染色，結果顯示早期凋亡和晚期凋亡細胞比例均隨毛蘭素作用的濃度增加而逐漸增加，體現(xiàn)為R3和R5區(qū)域細胞比例的逐漸增加（封三圖3）。毛蘭素作用濃度達到20 μmol/L，MUM-2B早期凋亡和晚期凋亡細胞比例均達到最大，分別為（37.01±3.52）%和（18.53±2.01）%，C918早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞比例分別為（32.91±3.12）%和（19.04±2.31）%。說明毛蘭素能夠誘導葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡，與上述實驗得出的推論一致。見表2。

2.5 毛蘭素對增殖和凋亡相關蛋白的影響

MUM-2B和C918細胞經(jīng)毛蘭素處理24 h后，提取總蛋白，進行免疫印跡分析，結果表明隨著毛蘭素作用濃度的增加，PARP總蛋白水平有顯著下調(diào)，p38 MAPK總蛋白有一定程度的下調(diào)，而p21、PARP活化形式（cl-PARP）和Caspase-3的活化形式（cl-Caspase3）顯著上調(diào)。見圖1。

3 討論

葡萄膜黑色素瘤為成人眼內(nèi)常見惡性腫瘤，5年生存率在17%～50%，主要死因為肝轉移，目前尚無有效治療手段[9]。開發(fā)抗葡萄膜黑色素瘤的藥物為目前的當務之急。中藥是我國最寶貴的傳統(tǒng)文化之一，從中藥入手分離出具有生物活性的中藥單體對于抗癌藥物開發(fā)具有重要意義，天然單體中有很多難以合成的結構，不少具有廣泛的生物學活性。毛蘭素作為石斛中分離出單體中的一種，已被證實具有較顯著的抗腫瘤藥理活性[10]，但是毛蘭素對葡萄膜黑色素細胞的作用未被報道過。

本研究顯示，毛蘭素可顯著抑制2株葡萄膜黑色素瘤細胞株的增殖，且有濃度依賴性，既往研究顯示，毛蘭素對多種腫瘤均有顯著的抑制效果，如膀胱癌[11]、肝癌[12]、腸癌[13]、乳腺癌[14]、胃癌[15，16]等，作用濃度在納摩爾和微摩爾之間，提示不同的癌細胞類型對毛蘭素的敏感性不同。為進一步探討毛蘭素抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖的機制，本文檢測了毛蘭素作用后細胞周期的變化，MUM-2B和C918細胞在毛蘭素作用后均存在較為顯著的G2/M期阻滯，表現(xiàn)為隨毛蘭素濃度增加，G2/M期比例逐漸增加，這一結果也與其他研究報道相符[7，17]。對細胞增殖相關蛋白表達量進行檢測。MAPK信號通路是維持細胞存活的重要通路[18]，被活化后可磷酸化核轉錄因子和蛋白激酶等多種底物，調(diào)節(jié)相關基因轉錄，促進細胞增殖，也被認為是細胞非控制性分裂的主要信號通路，在黑色素瘤細胞增殖過程中通過傳遞胞外信號發(fā)揮重要作用。研究顯示，UM中存在MAPK通路的異?；罨痆19]，并與皮膚中的黑色素瘤活化情況有所不同，對UM的侵襲和轉移均有影響。p38 MAPK是MAPK通路的其中一個亞型，其功能與細胞增殖、分化、存活、遷移密切相關，因而被用于研究癌細胞成因，且已被證明其在癌細胞中調(diào)節(jié)失控。本研究發(fā)現(xiàn)，毛蘭素作用MUM-2B和C918細胞后，p38 MAPK表達量均顯著下調(diào)，提示毛蘭素能抑制MAPK信號通路活化。

隨后通過Annexin V/PI染色進一步證實，毛蘭素可誘導細胞凋亡，體現(xiàn)為晚期和早期凋亡水平隨毛蘭素濃度增加而比例增加，對凋亡相關蛋白Caspase-3和PARP的活化形式檢測，表現(xiàn)為隨毛蘭素濃度增加而上調(diào)，進一步證實毛蘭素可誘導凋亡發(fā)生，與之前在膀胱癌中的研究相符[11]，但也有研究報道毛蘭素作用后未見有Caspase-3的活化[20]。Caspase-3 為細胞實現(xiàn)凋亡通路的主要功能蛋白，不論是外源性或者內(nèi)源性通路最終匯總信號，通過活化Caspase-3啟動凋亡。由此可以推斷，毛蘭素可能還存在其他誘導細胞死亡的通路。

綜上所述，毛蘭素能夠有效抑制葡萄膜黑色素瘤細胞C918、MUM-2B增殖，阻滯細胞周期，促進葡萄膜黑色素瘤細胞凋亡，且其作用效果呈現(xiàn)出一定范圍內(nèi)的劑量依賴性。其作用機制為毛蘭素能抑制p38 MAPK表達，阻斷MAPK信號通路，活化細胞凋亡途徑關鍵蛋白Caspase-3和PARP。后期我們將考慮進一步的體內(nèi)研究，以明確其對葡萄膜黑色素瘤的抑制效果。

[參考文獻]

[1] 向中正，劉磊. 葡萄膜黑色素瘤診療進展[J]. 華西醫(yī)學，2018，33（11）：1433-1440.

[2] 張雪琴，趙庭梅，劉靜，等. 石斛化學成分及藥理作用研究進展[J]. 中草藥，2018，49（13）：3174-3182.

[3] 莊夢婕，成景瑞，明海霞. 腫瘤失巢凋亡機制及其中醫(yī)藥對肺癌的治療研究進展[J]. 解放軍藥學學報，2016， 32（6）：551-554.

[4] Hsu JL，Lee YJ，Leu WJ，et al. Moniliformediquinone induces in vitro and in vivo antitumor activity through glutathione involved DNA damage response and mitochondrial stress in human hormone refractory prostate cancer[J].J Urol，2014，191（5）：1429-1438.

[5] Li YM， Wang HY， Liu GQ. Erianin induces apoptosis in human leukemia HL-60 cells[J]. Acta Pharmacol Sin，2001，22（11）：1018-1022.

[6] Sun J，F(xiàn)u X，Wang Y，et al. Erianin inhibits the proliferation of T47D cells by inhibiting cell cycles，inducing apoptosis and suppressing migration[J]. Am J Transl Res， 2016，8（7）：3077-3086.

[7] Wang H，Zhang T，Sun W，et al. Erianin induces G2/M-phase arrest，apoptosis，and autophagy via the ROS/JNK signaling pathway in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo[J]. Cell Death Dis，2016，7（6）：e2247.

[8] Yu Z，Zhang T，Gong C，et al. Erianin inhibits high glucose-induced retinal angiogenesis via blocking ERK1/2-regulated HIF-1α-VEGF/VEGFR2 signaling pathway[J]. Sci Rep，2016，6：34306.

[9] 裴超，劉靜霞. 脈絡膜黑色素瘤的研究進展[J]. 國際眼科雜志，2017，17（12）：2256-2259.

[10] 張小莉，安云鶴，程小艷，等. 毛蘭素抗腫瘤活性研究進展[J]. 分析儀器，2018，（1）：212-216.

[11] 朱啟彧. 毛蘭素誘導膀胱癌細胞凋亡及其分子機制[D]：西南交通大學，2013.

[12] 蘇鵬，王晶，安君霞，等. 毛蘭素對人肝癌Huh7細胞的抑制作用[J]. 應用與環(huán)境生物學報，2011，17（5）：662-665.

[13] 王亞蕓. 石斛生物堿提取及其抑制Caco-2活性的研究[D] ：北京林業(yè)大學，2015.

[14] 孫婧. 鐵皮石斛提取物及其活性成分毛蘭素對人乳腺癌細胞抑制作用的研究[D]. 吉林大學，2016.

[15] 劉名昆. 毛蘭素聯(lián)合5-Fu對人胃癌細胞株MGC-803增殖凋亡的影響[D] ：南華大學，2016.

[16] 洪衛(wèi)，郭勇，馬勝林，等. 毛蘭素對胃癌細胞SGC-7901端粒酶活性的影響[J]. 浙江實用醫(yī)學，2009，14（3）：181-182.

[17] Zhu Q，Sheng Y，Li W，et al. Erianin，a novel dibenzyl compound in Dendrobium extract，inhibits bladder cancer cell growth via the mitochondrial apoptosis and JNK pathways[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2019，371：41-54.

[18] 尹起亮，于瑩瑩，吳荻. 靶向MAPK信號通路的晚期黑素瘤治療現(xiàn)狀及展望[J]. 腫瘤，2018，38（8）：811-818.

[19] Zuidervaart W，van Nieuwpoort F，Stark M，et al. Activation of the MAPK pathway is a common event in uveal melanomas although it rarely occurs through mutation of BRAF or RAS[J]. Br J Cancer，2005，92（11）：2032-2038.

[20] 洪衛(wèi)，馬勝林，杜靈彬，等. 毛蘭素誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡的實驗研究[J]. 中國腫瘤，2008，（6）：499-501.

（收稿日期：2019-04-11）