石峻，趙紅敏

(西安市第九醫(yī)院 1．婦產科；2.超聲醫(yī)學科，西安 710054)

稽留流產(MA)是指胚胎或胎兒死亡后仍滯留宮腔內未能自然排出，又稱過期流產，多發(fā)生于妊娠12周以內，可導致彌散性血管內凝血(DIC)，發(fā)生凝血功能障礙，是一種較難處理的病理性妊娠類型[1]。MA病因復雜，與胚胎或胎兒染色體異常、母-胎界面免疫失衡、母體生殖道感染、母體內分泌異常、細胞增殖凋亡異常、子宮胎盤循環(huán)障礙、心理狀態(tài)等有關[2]。有研究認為[3]，除了胚胎或胎兒染色體異常導致早期流產這一常見因素，母-胎界面免疫失衡引起母體對胚胎的免疫排斥也是導致MA發(fā)生的重要因素。近年來母-胎界面脫膜組織在MA發(fā)病機制中的研究受到重視。受精卵著床后子宮內膜間質受蛻膜化誘導因子刺激增殖和再分化形成蛻膜組織，其功能的正常表達對妊娠建立與維持及分娩發(fā)動極為重要[4]。有研究顯示[5]，蛻膜組織中存在多種蛋白，其表達水平的差異對MA造成的影響不盡相同。CD47是一種廣泛表達于各種細胞表面膜蛋白，參與β3整合素介導的信號通路，對細胞生長、凋亡及遷移、血小板激活、細胞粘附、改變血管通透性等發(fā)揮作用[6]。鈣網蛋白(CRT)是內質網(ER)主要的鈣結合蛋白，根據其生物學功能可分為CRT的佐劑效應、胞外CRT的功能、細胞膜表面CRT的功能和內質網相關功能四個方面；CRT對維持Ca2+穩(wěn)態(tài)、協(xié)助蛋白質的折疊和加工、抑制血管生成、參與抗原提呈、細胞調亡等具有重要意義[7]。然而，關于CD47和CRT在人稽留流產胎膜組織中有無表達，及其之間是否存在一定關聯(lián)，目前未見報道。為此，本次研究通過對人稽留流產蛻膜組織中的CD47及CRT兩種蛋白進行檢測，觀察其表達情況。現報道如下：

資料與方法

一、研究對象

1.一般資料：選取2017年6月至2018 年10 月我院婦產科收治并診斷為稽留流產的40例患者資料進行研究，納入同期行人工流產的正常早孕患者為對照組(42例)。

2.稽留流產的診斷標準：(1)早孕反應消失，有先兆流產癥狀(陰道出血)或無任何癥狀；(2)子宮不再增大反而縮小，至妊娠中期時胎動消失或無胎動；(3)經婦科檢查可見宮頸口閉合，子宮較停經周數小、質地較硬，無胎心；(4)B超檢查發(fā)現子宮腔內胚囊不規(guī)則，囊內反射波紊亂，無胎心搏動；(5)實驗室檢查發(fā)現孕婦血清孕酮及絨毛膜促性腺激素(HCG值)低于正常值；(6)尿妊娠試驗呈陰性。

3.納入標準：(1)兩組孕婦年齡均在18～45 歲之間，妊娠時間均為6～12 w；(2)無全身感染性疾病及其他合并癥，流產前無任何用藥史；(3)既往無自然流產及死胎史，均為單胎妊娠早期流產；(4)月經周期規(guī)律，均無生殖系統(tǒng)異常、產道感染；(5)宮腔形態(tài)正常，無宮腔粘連、子宮畸形等子宮器質性病變等。

4.排除標準：(1)既往有習慣性流產史；(2)有腫瘤病史及妊娠期合并癥；(3)有家族遺傳病或系統(tǒng)性疾病等。

5.試劑及標本收集：SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)，兔抗重組人CRT抗體(Santa Cruz，美國)，兔抗人CD47抗體(Santa Cruz，美國)。標本收集：在患者排除感染期疾病后行常規(guī)消毒、麻醉，取膀胱截石位，利用彩色多普勒進行孕囊確認及擴宮，通過腹部B超引導，負壓吸引妊娠囊行刮宮術并收集其清除組織，將部分所得組織投入95%酒精中固定然后送至病理檢查，待蛻膜分離后利用4%多聚甲醛固定12～24 h。再將固定好蛻膜組織置于組織盒并放入全自動組織脫水機常規(guī)脫水、浸蠟，并用石蠟包埋，待檢。

二、方法

1.Western Blot檢測兩組患者蛻膜組織中CD47和CRT的表達情況：制備12%分離膠和6%濃縮膠，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用麗春紅S染液復染5 min，水中脫色，標記目的蛋白位置后，用蒸餾水洗滌5 min×3次，至完全脫色。將目的蛋白的NC膜條帶放入含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中，室溫下封閉2 h，取出NC膜，加入1∶500倍稀釋的一抗，室溫下緩慢搖動孵育4 h。然后PBST洗滌5 min×3次。然后加入1∶8 000倍稀釋的二抗，室溫下緩慢搖動孵育1 h，PBST洗滌5 min×3次，采用化學發(fā)光法，統(tǒng)計灰度值。

2.SP法檢測兩組患者蛻膜組織中CD47及CRT的表達情況：免疫組化SP法實驗方法[8]，石蠟切片，厚度約5 μm，常規(guī)脫蠟，采用1 500 ml檸檬酸鹽抗原修復，磷酸緩沖鹽溶液(PBS液)震蕩漂洗5 min，3次；然后進行免疫組織化學染色：滴加過氧化物酶(3% H2O2)阻斷試劑，室溫孵育20 min，滴加山羊血清工作液50 μl，室溫封閉20 min；滴加一抗50 μl/片，4℃恒溫箱過夜；加入生物素標記的二抗50 μl/片，37℃孵育30 min；加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液50 μl/片，37℃孵育30 min；PBS液漂洗，加入1～2滴DAB 液染色3～10 min，顯微鏡下觀察顯色情況；后將切片投入蘇木素染液復染5 min，滴加中性樹膠封片，干燥備用，記錄染色結果。對照組試驗用PBS 緩沖液代替一抗，其余操作過程同上。SP免疫組化染色法判定標準：依據顯微鏡下細胞核、胞漿或間質有黃色、棕黃色或深褐黃色顆粒判斷為陽性細胞。選取兩組患者蛻膜組織切片標本于顯微鏡下隨機觀察10個視野范圍(×400)，使用I mage Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測算，繪制兩組患者蛻膜組織陽性區(qū)域CRT及CD47的積分光密度值(IOD值)及IOD/Area值，分析其相關性。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料比較

稽留流產組(40例)：孕婦年齡21～38 歲，平均(25.6±2.5)歲；孕齡6～12 w，平均(9.7±1.6)w；BMI指數(23.4±3.1)kg/m2。對照組(42例)，孕婦年齡23～42歲，平均(26.1±2.3)歲；孕齡7～11 w，平均(8.5±1.3)w；BMI指數(22.7±3.9)kg/m2。兩組患者年齡、孕周等一般基本資料無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

二、Western Blot檢測兩組蛻膜組織中CD47和CRT的表達

結果表明，與對照組比較，稽留流產組患者蛻膜組織中CRT表達極顯著升高，CD47表達極顯著下降(P<0.01)(圖1)。

A：Western Blot檢測條帶圖；B：兩組蛻膜組織中CD47相對表達情況；C：兩組蛻膜組織中CRT相對表達情況。與對照組相比較，**P<0.01

三、SP法檢測兩組蛻膜組織中CD47和CRT的表達情況

CRT在脫膜組織中定位于細胞漿及胞膜呈陽性表達，稽留流產組患者蛻膜組織中CRT表達升高且高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2)。CD47在蛻膜組織中定位于細胞漿及胞膜呈陽性表達，稽留流產組患者蛻膜組織中CD47表達下降且低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3)。

A：兩組蛻膜組織中CRT免疫組化圖；B：兩組蛻膜組織單位面積內CRT濃度。與對照組相比較，**P<0.01

A：兩組蛻膜組織中CD47免疫組化圖；B：兩組蛻膜組織單位面積內CD47濃度。與對照組相比較，**P<0.01

四、兩組患者蛻膜組織中CRT及CD47的IOD值

稽留流產組患者蛻膜組織中CRT的IOD值顯著高于對照組，CD47的IOD值顯著低于對照組(P<0.01)。對兩組患者CRT與CD47的IOD值采用Pearman相關性分析，結果顯示稽留流產組40例患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈負相關(r=-0.648，P=0.012)，對照組患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈正相關(r=0.324，P=0.023)(表1)。

表1 兩組患者蛻膜組織中CRT及CD47表達(-±s)

討 論

MA是臨床中較常見的一種流產類型，近年來其發(fā)生率高達13.4%，發(fā)病機制尚不明確，降低MA的發(fā)生率，預防不良妊娠結局發(fā)生，對我國優(yōu)生優(yōu)育有著深遠的意義。蛻膜組織使母體和胎兒建立密切聯(lián)系，胚胎通過蛻膜組織從母體獲得營養(yǎng)物質。子宮蛻膜功能的正常表達在妊娠過程中非常重要，當蛻膜組織微環(huán)境被破壞后，可能使母體對胎兒無法耐受，發(fā)生免疫排斥導致流產的發(fā)生，因此，母-胎界面免疫失衡可能是誘發(fā)MA的重要因素。CD47參與胚胎植入和發(fā)育、使蛻膜增殖分化與凋亡、促進胎盤新生血管的形成等，其表達異常會導致免疫調節(jié)失衡，阻礙胎盤新生血管形成，從而導致不良妊娠結局[8]；CRT表達異常可抑制血管的生成，增強吞噬細胞活性，介導細胞凋亡和清除。有文獻報道[9]，凋亡細胞膜表面CRT升高的同時，伴隨CD47表達量的明顯下降，兩者共同作用可增強吞噬細胞的吞噬效率。

CD47與SIRPα結合通過抑制巨噬細胞的活性，保證自身正常細胞不被巨噬細胞吞噬[10]。CD47表達缺失可能會增加巨噬細胞活性和胎盤血管的形成障礙，導致母體對胎兒發(fā)生免疫排斥，從而導致MA發(fā)生[11]。研究采用Western Blot法對兩組患者蛻膜組織中CD47和CRT的表達情況進行檢測發(fā)現，與對照組比較稽留流產組患者蛻膜組織中CRT表達升高，CD47表達下降，統(tǒng)計有顯著性差異(P<0.01)。免疫組化SP法檢測發(fā)現CD47在蛻膜組織中定位于細胞漿及胞膜呈陽性表達，與對照組比較，稽留流產組蛻膜組織中CD47表達下降且顯著低于對照組(P<0.01)。說明CD47低表達會影響母-胎界面免疫失衡，在MA的發(fā)生過程中可能起到了推動作用。細胞凋亡早期，細胞膜表面CRT的出現要早于磷脂酰絲胺酸(PS)，細胞凋亡時，CRT會由細胞內轉向細胞膜表面，并密集分布，這種異常表達和存在于巨噬細胞表面的受體相關蛋白(LDL)結合，向巨噬細胞發(fā)出信號，以便及時清除凋亡細胞，避免局部炎癥反應的出現[12-13]。在關于妊娠小鼠蛻膜CRT表達的試驗結果顯示[14]，妊娠小鼠的脫膜組織中和未孕小鼠的子宮內膜中均存在CRTmRNA的表達，妊娠小鼠脫膜組織中CRT水平顯著高于未孕小鼠子宮內膜組織，小鼠在妊娠第4～5 d時CRT達到高峰，之后CRT下降，說明CRT對胚胎植入可能發(fā)揮一定作用。也有研究表明CRT對小鼠胚胎的心臟發(fā)育有一定影響，正常情況下CRT在小鼠妊娠的第9天左右被激活，第18天后CRT表達開始減弱；而在CRT過度表達的小鼠或存在CRT基因缺陷的小鼠中，其心肌厚度病理改變，最終小鼠胚胎因心臟功能紊亂而死亡[15]。研究中顯示，CRT在兩組脫膜組織中也定位于細胞漿及胞膜呈陽性表達，稽留流產組患者蛻膜組織中CRT表達升高且顯著高于對照組(P<0.01)。說明在胚胎著床后MA患者蛻膜組織中CRT合成增加，可能導致CRT由細胞內質網轉移至細胞表面，從而釋放大量的吞噬信號，增加了巨噬細胞活性，同時CRT的增高，抑制了血管生成，介導細胞凋亡，對MA的發(fā)生起到推動作用。此外，研究中通過分析兩組蛻膜組織中CD47及CRT的IOD值發(fā)現，稽留流產組患者蛻膜組織中CRT的IOD值高于對照組，CD47的IOD值顯著低于對照組(P<0.01)；并對兩組患者CRT與CD47的IOD值采用Pearman相關性分析，結果顯示稽留流產組40例患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈負相關(r=-0.648，P=0.012)，對照組患者蛻膜組織中CRT與CD47的IOD值呈正相關(r=0.324，P=0.023)。說明CRT與CD47的平衡表達可能對母-胎界面免疫環(huán)境的穩(wěn)定和免疫耐受過程具有重要作用；本研究僅對蛻膜組織的CRT、CD47進行半定量檢測，結果說明CRT、CD47可能與MA存在一定關聯(lián)。母-胎界面存在多種免疫活性細胞，其究竟是通過脫膜基質細胞/脫膜免疫細胞還是滋養(yǎng)細胞參與母-胎界面平衡，仍需進一步研究。

綜上所述，蛻膜組織中CRT、CD47的異常表達，可能對MA進程發(fā)揮作用。