薛林濤，王世凱，覃捷，李政達(dá)，周亭亭，毛獻(xiàn)寶，張小慧，韋娉嬪，劉慶友，譚衛(wèi)紅*

(1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧 530021；2.廣西大學(xué)亞熱帶生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004)

隨著囊胚培養(yǎng)體系的不斷完善及玻璃化冷凍技術(shù)的成功應(yīng)用，玻璃化凍融囊胚移植在體外受精治療周期中已成為一種常規(guī)技術(shù)。為了提高囊胚玻璃化凍融復(fù)蘇效果及胚胎種植效率，許多研究采用在玻璃化冷凍前后對囊胚進(jìn)行透明帶激光操作，這主要包括冷凍前激光人工皺縮(Artificial shrinking，AS)和解凍后激光輔助孵化(Artificial hatching，AH)，但是由于缺乏大規(guī)模隨機(jī)臨床對照試驗(yàn)證據(jù)支撐，囊胚透明帶操作的臨床應(yīng)用仍然存在爭議[1]。而時(shí)差胚胎培養(yǎng)監(jiān)測技術(shù)(Time-lapse)的出現(xiàn)可以實(shí)現(xiàn)對胚胎體外發(fā)育全程進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，獲取胚胎發(fā)育生理事件發(fā)生時(shí)間點(diǎn)和動態(tài)模式的量化數(shù)據(jù)，在胚胎發(fā)育研究方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[2]。本研究選擇體外受精周期病人的剩余囊胚，采用隨機(jī)對照試驗(yàn)，利用Time-lapse系統(tǒng)監(jiān)測不同透明帶激光操作方式對玻璃化凍融囊胚復(fù)蘇后的孵出模式和動態(tài)發(fā)育參數(shù)的影響，探討透明帶激光操作在囊胚玻璃化凍融周期中的應(yīng)用價(jià)值和安全性。

資料與方法

一、研究對象

本研究所用胚胎均來源于2017年4月至2018年6月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心接受體外受精治療患者移植或冷凍后的剩余囊胚。研究所用囊胚評級方法參照Gardner囊胚分級法[3]。

囊胚入選標(biāo)準(zhǔn)為：受精方式為體外受精，且冷凍前囊胚透明帶完整；受精后第6天囊胚；囊胚分期為3期和4期；囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評級均≥C級。

囊胚排除標(biāo)準(zhǔn)為：冷凍前囊胚腔發(fā)生自然皺縮；冷凍過程中除本研究分組設(shè)計(jì)的激光人工皺縮操作外，其他原因?qū)е履遗咄该鲙茡p者。

獲所有患者知情同意并簽署科研知情同意書，且通過倫理委員會批準(zhǔn)(KYZC-2015-01)。

二、研究方法

1.試驗(yàn)分組：囊胚冷凍前隨機(jī)分為人工皺縮組(AS組，接受激光人工皺縮后冷凍)和未人工皺縮組(NAS組，直接冷凍)兩組；每組囊胚解凍后再隨機(jī)分為輔助孵化組(AH組，激光輔助孵化)和未輔助孵化組(NAH組，直接培養(yǎng))兩個(gè)亞組。因而，本研究中囊胚共分為4組，即AS+AH組、AS+NAH組、NAS+AH組和NAS+NAH組。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組。

2.囊胚玻璃化冷凍及解凍：囊胚玻璃化冷凍及解凍均采用COOK玻璃化冷凍解凍試劑盒(K-SIBV/W-5000，COOK，澳大利亞)。所有試劑使用前預(yù)熱平衡至37℃，具體操作過程參見文獻(xiàn)[4]。冷凍載體為HSV封閉式載桿(025250，Cry Bio System，法國)，每個(gè)載桿均放置一個(gè)囊胚。

3.囊胚激光人工皺縮及輔助孵化：囊胚透明帶激光操作采用OCTAX激光破膜儀(OCTAX，MTG，德國)。囊胚冷凍前將其放置于激光專用物鏡下，打開激光發(fā)射器的鎖定水平位，將其放置在囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對側(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞連接處，調(diào)節(jié)激光發(fā)射時(shí)間給予單次激光打孔，而后放置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min，待囊胚腔完全皺縮后進(jìn)行玻璃化冷凍；囊胚解凍后立即進(jìn)行激光輔助孵化，選擇透明帶間隙較大或碎片較多處作為孵化部位，激光溶解約1/4透明帶，而后清洗換液移入時(shí)差培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。

4.囊胚時(shí)差培養(yǎng)監(jiān)測：囊胚解凍后移入預(yù)先配制的9孔Primo Vision時(shí)差培養(yǎng)皿(16606，Vitrolife，丹麥)，其中加入37℃、6%CO2平衡過夜的囊胚培養(yǎng)液，而后放入Primo Vision(Primo Vision Evo，Vitrolife，匈牙利)時(shí)差胚胎監(jiān)測系統(tǒng)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、6%CO2、5%O2。培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)先安裝好Primo Vision時(shí)差系統(tǒng)鏡頭并連接Analyzer圖像分析軟件，設(shè)置圖像拍攝間隔頻率為5 min，7個(gè)等距焦平面掃描間隔頻率為60 min。

5.觀察指標(biāo)：采用Time-lapse監(jiān)測解凍囊胚發(fā)育進(jìn)程，所有動態(tài)發(fā)育參數(shù)時(shí)間點(diǎn)判定由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)技術(shù)人員完成。解凍囊胚繼續(xù)培養(yǎng)后囊胚腔重新擴(kuò)張且充滿透明帶判定為囊胚復(fù)蘇成功，該時(shí)間點(diǎn)判定為囊胚復(fù)張時(shí)間；囊胚細(xì)胞從透明帶開始外溢判定為囊胚孵出，該時(shí)間點(diǎn)判定為囊胚孵出開始時(shí)間；囊胚細(xì)胞完全擺脫透明帶整體從透明帶中溢出判定為囊胚完全孵出，該時(shí)間點(diǎn)判定為囊胚完全孵出時(shí)間；囊胚細(xì)胞從透明帶缺口溢出但未使缺口擴(kuò)大，在透明帶內(nèi)外兩側(cè)形成8字型囊胚腔判定為8字型孵出；囊胚腔作為一個(gè)整體從透明帶缺口呈U型溢出判定為U型孵出；囊胚培養(yǎng)過程中成腔囊胚腔液自然釋放皺縮成無腔囊胚判定為囊腔回縮，一次囊腔皺縮并重新擴(kuò)張周期判定為一次囊腔回縮。具體見圖1。

A：皺縮囊胚；B：復(fù)張囊胚；C：激光人工皺縮囊胚(紅色箭頭示透明帶開孔)；D：8字型孵出囊胚；E：激光輔助孵化皺縮囊胚(綠色箭頭示透明帶開孔)；F：囊胚開始孵出；G：U型孵出囊胚；H：完全孵出囊胚

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

本研究共納入212個(gè)囊胚，根據(jù)分組方法隨機(jī)分為AS+AH組、AS+NAH組、NAS+AH組、NAS+NAH組共計(jì)4個(gè)亞組，每組各53個(gè)囊胚。3期囊胚占比分別為5.66%(3/53)、9.43%(5/53)、5.66%(3/53)、9.43%(5/53)，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

一、透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚復(fù)蘇效率及孵出模式的影響

AS+AH組及AS+NAH組囊胚解凍后復(fù)蘇率顯著高于NAS+AH組及NAS+NAH組(P<0.05)，而AS+AH組與AS+NAH組、NAS+AH組與NAS+NAH組亞組間囊胚解凍后復(fù)蘇率無顯著差異(P>0.05)；NAS+NAH組的孵出率顯著低于其余3組(P<0.05)。在孵出模式的對比中，與AS+AH組相比，AS+NAH組和NAS+NAH組的完全孵出率及U型孵出率均顯著下降，而8字型孵出率顯著升高(P均<0.05)，但NAS+AH組各指標(biāo)與之無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；NAS+AH和NAS+NAH組在孵出率、完全孵出率及U型孵出率上有顯著差異，后者較前者顯著下降(P<0.05)(表1)。

二、透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚孵出動態(tài)參數(shù)的影響

4組囊胚解凍后復(fù)張時(shí)間無顯著差異(P>0.05)；NAS+NAH組囊胚孵出開始時(shí)間顯著晚于其他3組(P<0.05)；AS+NAH組及NAS+NAH組囊胚完全孵出時(shí)間顯著晚于AS+AH組與NAS+AH組(P<0.05)；AS+AH組與NAS+AH組囊腔回縮次數(shù)顯著少于AS+NAH組及NAS+NAH組(P<0.05)(表2)。

表1 透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚復(fù)蘇及孵出模式的影響(%)

注：與AS+AH組比較，*P<0.05；與AS+NAH比較，#P<0.05；與NAS+AH組比較，&P<0.05

表2 透明帶激光操作對玻璃化凍融囊胚發(fā)育及孵出動態(tài)參數(shù)的影響(-±s)

注：與NAS+NAH組比較，*P<0.05；與AS+NAH組比較，#P<0.05

討 論

玻璃化冷凍是目前囊胚凍存的常規(guī)技術(shù)，其通過高濃度的冷凍保護(hù)劑使胚胎細(xì)胞充分脫水，在快速降溫過程中細(xì)胞內(nèi)水分子由液相直接轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)玻璃相，從而避免冷凍過程中冰晶形成所造成的細(xì)胞損傷。玻璃化冷凍技術(shù)在臨床的成功應(yīng)用顯著提高了囊胚凍融的效率。但是也有研究提出，囊胚腔液的存在導(dǎo)致囊胚冷凍過程中無法充分脫水，其殘留的水分子致使降溫過程中冰晶形成，是凍融囊胚細(xì)胞損傷的主要風(fēng)險(xiǎn)[5]，而采用人工皺縮方式在囊胚冷凍前釋放腔內(nèi)液體，可顯著提高囊胚玻璃化凍融的臨床效率[6]，同時(shí)由于激光脈沖操作簡單快速，激光人工皺縮在臨床上應(yīng)用最為廣泛[7]。本研究通過隨機(jī)對照試驗(yàn)比較了激光人工皺縮對囊胚玻璃化凍融復(fù)蘇效果的影響，結(jié)果顯示冷凍前進(jìn)行激光人工皺縮的囊胚凍融后復(fù)蘇率顯著高于未皺縮囊胚(83.02% vs.54.72%，P=0.003；88.68% vs.64.15%，P=0.005)；同時(shí)，對于解凍后未行輔助孵化的囊胚，人工皺縮組的囊胚孵出開始時(shí)間顯著早于未皺縮組[(445.86±423.62) vs.(732.75±448.45)min，P=0.026)，囊胚孵出率也顯著高于未皺縮組(74.47% vs.23.53%，x2=20.55，P<0.001)，這說明囊胚冷凍前通過人工皺縮方式使囊胚腔液充分釋放，有助于最大程度減少胚胎內(nèi)殘存水分子，降低玻璃化凍融過程中冰晶形成的風(fēng)險(xiǎn)，提高凍融囊胚發(fā)育潛力。

透明帶是卵母細(xì)胞外周由糖蛋白構(gòu)成的嗜酸性膜，其在早期胚胎發(fā)育過程中起到營養(yǎng)通道和保護(hù)屏障的重要作用，但是囊胚形成后適時(shí)從透明帶中孵出是胚胎宮內(nèi)種植的關(guān)鍵生理事件，早期研究發(fā)現(xiàn)胚胎冷凍過程會造成透明帶硬化從而導(dǎo)致囊胚孵出困難[8]，而人工輔助孵化可以降低囊胚孵出能量消耗閾值，從而有利于囊胚完成孵出，但是目前人工輔助孵化在臨床中的應(yīng)用仍存爭議。有研究認(rèn)為解凍囊胚進(jìn)行人工輔助孵化可以獲得更高的臨床妊娠率[9]，尤其對于形態(tài)評級較低或者受精后第6天形成的囊胚，輔助孵化能夠顯著提高其種植效率[10]，同時(shí)也有研究認(rèn)為輔助孵化無助于解凍囊胚移植周期臨床結(jié)局改善，美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會關(guān)于輔助孵化在輔助生殖周期應(yīng)用的共識僅將其列為C級證據(jù)[11]，中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識也不推薦所有移植胚胎進(jìn)行輔助孵出[12]。究其原因，目前關(guān)于輔助孵化是否適宜主要依據(jù)的是臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，而影響胚胎種植的混雜因素眾多，需要大樣本量設(shè)計(jì)嚴(yán)格的試驗(yàn)以明確單個(gè)因素的真實(shí)影響，而目前尚缺乏相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道；同時(shí)，由于臨床試驗(yàn)研究中的研究指標(biāo)多為臨床妊娠率及種植率等，而無法對囊胚宮腔內(nèi)移植后的發(fā)育過程進(jìn)行追蹤及量化分析。因此，有研究提出應(yīng)用Time-lapse對囊胚解凍后體外的發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行動態(tài)追蹤，可以獲取囊胚發(fā)育及孵化相關(guān)的更為詳細(xì)直觀的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]，在研究透明帶操作對囊胚發(fā)育影響方面更具優(yōu)勢。Goto等[14]通過Time-lapse監(jiān)測小鼠囊胚體外發(fā)育發(fā)現(xiàn)，透明帶輔助孵化的小鼠囊胚孵出時(shí)間顯著早于透明帶完整囊胚；Ueno等[15]研究發(fā)現(xiàn)采用激光部分去除或者完全去除透明帶的人體外受精周期解凍囊胚，其完全孵出率顯著高于透明帶完整囊胚，同時(shí)囊胚在纖連蛋白涂層培養(yǎng)皿中的體外粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，完全去除透明帶的囊胚發(fā)生粘附時(shí)間和細(xì)胞增殖擴(kuò)展速率顯著快于透明帶部分去除或透明帶完整囊胚。本研究結(jié)果也顯示解凍囊胚進(jìn)行激光輔助孵化后囊胚孵出率和完全孵出率顯著提高，同時(shí)囊胚的孵出開始時(shí)間和完全孵出時(shí)間也顯著早于未輔助孵化囊胚；另外還發(fā)現(xiàn)輔助孵化囊胚的囊腔回縮次數(shù)顯著少于未輔助孵化囊胚，這說明透明帶輔助孵化降低了囊胚孵出所需要的能量閾值，提高了囊胚孵出的速度和效率，有利于囊胚順利擺脫透明帶束縛從而進(jìn)入胚胎植入階段。

囊胚透明帶操作雖然在提高冷凍復(fù)蘇和孵出效率上具有優(yōu)勢，但是也存在一定風(fēng)險(xiǎn)。目前臨床最具爭議的是單卵雙胎的發(fā)生，尤其對于冷凍前激光人工皺縮囊胚，激光在透明帶上的細(xì)小開孔會人為制造囊胚孵出突破點(diǎn)，理論上會導(dǎo)致囊胚8字型孵出模式風(fēng)險(xiǎn)增加，而囊胚8字型孵出過程中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)易受到硬化透明帶嵌頓發(fā)生內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離，這是單卵雙胎形成的最主要機(jī)制[16]。本研究通過Time-lapse監(jiān)測解凍囊胚孵出的動態(tài)模式結(jié)果也顯示，冷凍前激光人工皺縮的囊胚如果解凍后不進(jìn)行人工輔助孵化，囊胚8字型孵出率顯著增高，這也證實(shí)了以上假設(shè)；同時(shí)本研究結(jié)果也提示解凍后透明帶輔助孵化能夠顯著改變囊胚孵出模式，輔助孵化組的囊胚8字型孵出率顯著下降，囊胚孵出模式主要呈U型孵出。另外本研究也發(fā)現(xiàn)8字型孵出囊胚的完全孵出率顯著下降，Time-lapse動態(tài)監(jiān)測視頻顯示該類型囊胚細(xì)胞大多從透明帶開孔溢出，而通過囊胚腔回縮復(fù)張使透明帶變薄和開孔增大的能力顯著減弱，從而導(dǎo)致囊胚無法完全孵出，尤其對于質(zhì)量較差或凍融過程細(xì)胞受損的囊胚，發(fā)生此類風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)率更高，而此類囊胚在與子宮內(nèi)膜識別黏附過程中由于透明帶的影響勢必降低種植能力。因此，解凍囊胚特別是冷凍前人工皺縮囊胚進(jìn)行輔助孵化有利于囊胚正常孵出。

綜上所述，激光人工皺縮能夠提高囊胚玻璃化凍融復(fù)蘇效率，但是人工皺縮導(dǎo)致的透明帶開孔增加了解凍囊胚孵出異常的風(fēng)險(xiǎn)，而激光輔助孵化可以改善囊胚孵出效率，有助于囊胚正常孵出，因此激光人工皺縮聯(lián)合激光輔助孵化可以常規(guī)應(yīng)用于囊胚玻璃化凍融周期，在改善囊胚復(fù)蘇及孵出結(jié)局上具有一定價(jià)值。