李小芳，吳宏斌，馬兆堂*

（1. 泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)新藥申報服務(wù)中心，江蘇 泰州 225300；2. 江蘇省疫苗工程技術(shù)研究中心，江蘇 泰州 225300）

美國FDA于2004年發(fā)表了關(guān)于過程分析技術(shù)（process analysis technology，PAT）的指南：《PAT——創(chuàng)新藥物的研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量保證框架》，指明PAT是通過對相關(guān)原材料、中間物料及工藝的關(guān)鍵參數(shù)和指標進行實時監(jiān)測，集設(shè)計、分析和生產(chǎn)控制為一體的系統(tǒng)，和傳統(tǒng)質(zhì)量保證手段相比，具有非常明確的優(yōu)勢。該指南鼓勵研發(fā)創(chuàng)新，代表著FDA對未來醫(yī)藥產(chǎn)品研發(fā)和制造的愿景。2011年，F(xiàn)DA發(fā)布《工藝驗證指南》，強調(diào)了對質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）和PAT的支持。我國2010版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》中明確指出：藥品生產(chǎn)管理和質(zhì)量控制的基本要求，旨在最大限度地降低藥品生產(chǎn)過程中污染、交叉污染以及混淆、差錯等風險，確保持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)出符合既定用途和注冊要求的藥品。

全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，據(jù)美國相關(guān)機構(gòu)統(tǒng)計，全球生物醫(yī)藥產(chǎn)值在2010—2020年間保持年均增速約13.5%[1]。中國生物醫(yī)藥市場未來5～10年的發(fā)展主流也將會與世界同步，尤其是新型疫苗和單抗藥物獲得顯著發(fā)展。PAT作為一個新的技術(shù)、理念和方法，在國內(nèi)發(fā)展較晚，其主要被用于化藥合成和中藥生產(chǎn)，而生物制品由于工藝復雜性，PAT研究應用相對較少。近年來，國家從戰(zhàn)略和政策層面不斷加大對醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級，從藥品一致性評價、藥品管理法修訂，到關(guān)聯(lián)審評、全面藥品上市許可持有人（MAH）制度。在歷史性變革發(fā)展的新形勢下，醫(yī)藥企業(yè)正面臨解決技術(shù)升級、提升產(chǎn)品質(zhì)量、提高環(huán)保標準、降低安全風險等在優(yōu)化技術(shù)工藝過程中的各種問題。2018年，具有重大影響的“疫苗事件”，充分暴露了國內(nèi)生物制品企業(yè)在生產(chǎn)中風險控制和質(zhì)量管理的缺失，因此亟需更先進的過程控制策略。PAT作為規(guī)范生產(chǎn)過程的有效工具，在提高效率的同時可降低藥品質(zhì)量風險。本文從生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢、監(jiān)管要求以及PAT工具入手，探討了PAT在生物制品研發(fā)生產(chǎn)工藝中最新進展和前景，旨在為我國生物制藥行業(yè)質(zhì)量控制的發(fā)展提供參考。

1 質(zhì)量源于設(shè)計理念

人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會關(guān)于藥品研發(fā)的指導原則（ICH Q8）指出，質(zhì)量不是通過檢驗注入到產(chǎn)品，而是通過設(shè)計賦予。FDA認為，QbD是從產(chǎn)品開發(fā)到工業(yè)化生產(chǎn)的精心設(shè)計，是對產(chǎn)品屬性及其與生產(chǎn)工藝關(guān)系的透徹理解，另外QbD也是藥品動態(tài)生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（current Good Manufacture Practices，cGMP）的基本組成部分，有助于GMP在藥企中更好的實施。QbD通過合理的實驗設(shè)計，研究原料、產(chǎn)品質(zhì)量屬性和工藝參數(shù)之間的關(guān)系，目的是加強對產(chǎn)品和工藝的理解以及過程控制[2]。QbD關(guān)注設(shè)計、工藝、材料、設(shè)施等，將風險評估應用到產(chǎn)品全周期中[3]，如圖1所示。

圖1 QbD風險評估工具決策架構(gòu)Figure 1 Decision-making framework of QbD risk assessment tools

2 過程分析技術(shù)工具應用

在藥品生產(chǎn)質(zhì)量控制中，將PAT貫徹于QbD，兩者相輔相成，可以縮短生產(chǎn)周期，防止產(chǎn)生廢品及增加返工程序，提高自動化水平，實現(xiàn)實時放行，減少人為錯誤，加強操作安全性，優(yōu)化能源與原料利用率，提升過程可控性，確悉關(guān)鍵的可變參數(shù)，實施持續(xù)性管控藥品質(zhì)量屬性[4]。表1介紹了PAT工具的應用情況[5]，這種應用與目前大多數(shù)制藥企業(yè)在生產(chǎn)后期分析測定產(chǎn)品質(zhì)量的運營方式不同，但是與FDA的觀點相符，通過對整體生產(chǎn)過程進行更深入的管理和控制，將質(zhì)量根植于產(chǎn)品。

3 生物醫(yī)藥智能制造

我國政府提出“中國制造2025”規(guī)劃，以應對新一輪科技革命和產(chǎn)業(yè)變革，立足于我國轉(zhuǎn)變經(jīng)濟發(fā)展方式的實際需求，圍繞創(chuàng)新驅(qū)動、智能轉(zhuǎn)型、綠色發(fā)展，提出加快制造業(yè)轉(zhuǎn)型升級、信息技術(shù)融合發(fā)展、拓展“智能+”的重大戰(zhàn)略任務(wù)和重大政策舉措。生物醫(yī)藥制造業(yè)的變革方向也將往自動化、信息化和智能化發(fā)展。自動化可以避免人工操作帶來的生產(chǎn)偏差及因此引起的一系列成本，使生產(chǎn)出來的產(chǎn)品穩(wěn)定；信息化是智慧車間的重要手段，基于大數(shù)據(jù)分析對生物醫(yī)藥制備過程進行有效診斷監(jiān)管；智能化是終極方向，生物醫(yī)藥企業(yè)將使用計算機網(wǎng)絡(luò)人工智能（arti ficial intelligence，AI）技術(shù)融合智能制造裝備，構(gòu)建高效節(jié)能、質(zhì)量可靠的智慧工廠，實現(xiàn)智能生產(chǎn)[6]。Li等[7]介紹了一個PAT案例，通過四元隔膜泵、計算機、可編程邏輯控制器（PLC），聯(lián)合在線傳感器，對疫苗產(chǎn)品純化層析中pH值及電導率實行自動化精準控制。

表1 過程分析技術(shù)工具在工藝質(zhì)量控制中的應用Table 1 Application of PAT tools in process quality control

不少國際知名制藥企業(yè)已經(jīng)走在了“工業(yè)4.0”的前沿，例如輝瑞公司一直致力于先進創(chuàng)新技術(shù)與解決方案的研究，基于智能生產(chǎn)理念，利用最新自動化和相關(guān)學科知識，將實時放行（RTR）與連續(xù)化生產(chǎn)變成現(xiàn)實；諾華公司與麻省理工大學合作在巴塞爾建立試驗工廠，研發(fā)的新藥從向FDA申報注冊時，即為連續(xù)化生產(chǎn)工藝，提高設(shè)備使用效率，實現(xiàn)更高的生產(chǎn)率并確保最終產(chǎn)品的高質(zhì)量[8]。我國生物醫(yī)藥公司應當與國際企業(yè)站在同一個制高點，推動國內(nèi)生物醫(yī)藥行業(yè)升級，實現(xiàn)生物醫(yī)藥智能生產(chǎn)的新目標，逐漸完善智能制造體系建設(shè)。

4 上游工藝研究應用

上游流程重點在發(fā)酵或細胞培養(yǎng)階段，由于發(fā)酵和細胞培養(yǎng)工序是產(chǎn)物和雜質(zhì)產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟，極具重要性，在此步驟控制好雜質(zhì)將極大地有助于后期處理工藝。發(fā)酵和細胞培養(yǎng)液的特點是組成復雜，通常氣、固、液三相共存，其組分和含量不斷變化。由于生物制品的復雜性和特異性，以及缺乏在線評估其質(zhì)量屬性的儀器，PAT在生物制品領(lǐng)域的應用受到限制。通過測定發(fā)酵或細胞培養(yǎng)中微生物/細胞數(shù)量、活性、營養(yǎng)物、代謝物、產(chǎn)物等指標，及其與溫度、體積、pH、溶氧、流速、電導的關(guān)系，研究微生物/細胞培養(yǎng)過程的主要影響因素，并考察關(guān)鍵因素與產(chǎn)品表達的相關(guān)性，從而保證發(fā)酵和細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性，降低傳統(tǒng)的取樣離線分析帶來的污染風險，提升藥品質(zhì)量管理水平。

4.1 微生物發(fā)酵工藝

通過傳感器、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、流動注射分析（FIA）、高效液相色譜（HPLC）、電化學分析、質(zhì)譜、2D熒光光譜、多元線性回歸（MLR）、近紅外光譜技術(shù)（NIR）等技術(shù)單獨或聯(lián)合使用，對微生物的發(fā)酵過程進行監(jiān)測，提供實時數(shù)據(jù)，研發(fā)過程中優(yōu)化發(fā)酵工藝，生產(chǎn)過程中確保產(chǎn)品穩(wěn)定均一。Van de Merbel等[9]利用微孔超濾膜聯(lián)合色譜系統(tǒng)進行在線監(jiān)測，通過監(jiān)測生物量、比生長率、產(chǎn)物和副產(chǎn)物濃度等參數(shù)變化，控制發(fā)酵過程。Gnoth等[10]在大腸埃希菌發(fā)酵過程中，利用蛋白產(chǎn)率與菌體比生長速率、發(fā)酵溫度之間的相關(guān)性，建立了混合模型，結(jié)果顯示，最優(yōu)化條件下可提升目標蛋白25%產(chǎn)量，同時避免了包涵體的形成。常曉慧[11]利用NIR分析菌株發(fā)酵過程中原料消耗量和產(chǎn)物生成量，建立定量模型，判斷菌株的發(fā)酵能力，該模型具有很好的擬合度和預測性能，因此NIR可開發(fā)成為高通量篩選菌株的有效工具。Ghader等[12]利用頂空-固相微萃取技術(shù)（HS-SPME）聯(lián)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（GC-MS）對發(fā)酵罐尾氣中含硫化合物等揮發(fā)性有機物（VOC）含量進行測定，從而在線監(jiān)測破傷風桿菌發(fā)酵流程，表明通過合適的技術(shù)測定特定生物標志物可作為一種新穎的發(fā)酵過程分析方法。

4.2 哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝

一次性生物反應器為細胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢之一，其應用廣泛，在PAT應用上正在向更大規(guī)模、更高配置以及與下游純化技術(shù)相結(jié)合的方向發(fā)展。細胞培養(yǎng)分析技術(shù)方法更為豐富，往往通過不同技術(shù)間以及與傳感器之間的組合來進行研究。常見的傳感器包括原位傳感器、生物量傳感器（結(jié)合流式細胞術(shù)）、電子鼻舌傳感器、膜傳感器[歐洲生物技術(shù)聯(lián)合會（EFB）推薦]、柔性傳感器等。常用的技術(shù)包括NIR、FIA、離子遷移譜技術(shù)（IMS）、介電譜技術(shù)、二維核磁共振波譜技術(shù)、拉曼光譜技術(shù)、多波長熒光技術(shù)、射頻技術(shù)（RF）、原位顯微鏡技術(shù)（ISM）、生物高效液相色譜技術(shù)（Bio HPLC）等[13]。

Kuystermans等[14]利用全自動樣品處理器及流式細胞技術(shù)實時監(jiān)測中國倉鼠卵巢（CHO）細胞培養(yǎng)過程中的凋亡量，從而監(jiān)控培養(yǎng)動態(tài)、提升產(chǎn)物產(chǎn)量及質(zhì)量，該方法是一種新穎而有效的技術(shù)手段。Teixeira等[15]利用原位二維熒光技術(shù)結(jié)合化學計量統(tǒng)計，監(jiān)測哺乳動物細胞培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵生物工藝參數(shù)，包括活細胞密度和重組蛋白濃度，據(jù)驗證準確度達到91%以上，可實時監(jiān)測細胞濃度和抗體滴度。Esmonde-White等[16]報道，利用表面增強拉曼光譜技術(shù)（SERS）、以及拉曼光譜聯(lián)合非線性模型預測控制器（NMPC），對CHO細胞培養(yǎng)中營養(yǎng)物濃度等參數(shù)進行監(jiān)控，正在從實驗研究往GMP生產(chǎn)應用上發(fā)展。另外，利用上述技術(shù)結(jié)合多變元（MVA）數(shù)據(jù)分析手段，對生物反應器內(nèi)培養(yǎng)液定期掃描，再通過預先建立的數(shù)學模型對過程參數(shù)實時監(jiān)測，可以在實際生產(chǎn)中進行真正意義上的生物過程質(zhì)量檢測、分析與控制[17]。

5 收獲階段研究應用

微孔過濾、深層過濾、均質(zhì)化、離心和沉淀是生物技術(shù)產(chǎn)品收獲中最常用的一些單元操作。收獲工藝的目標通常是對上游步驟獲得的發(fā)酵液進行預處理，以便下游操作進一步精制純化。目的就是最大限度地提高產(chǎn)物回收率，并避免產(chǎn)物的降解。在生物制品收獲工藝中，PAT的應用不如其他生產(chǎn)階段，與上游工藝相比，收獲流程的PAT研究相對較少。這可能是因為收獲步驟對最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響有限，因此，實施PAT技術(shù)的優(yōu)勢不如上游或下游流程那么重要。但是也有一些產(chǎn)物對穩(wěn)定性等方面有獨特的要求，會將PAT應用于此階段，比如利用NIR技術(shù)監(jiān)測收獲過程中活性藥物成分（API）濃度；再如利用中空纖維膜提取分離發(fā)酵過程中產(chǎn)生的單克隆抗體，通過色譜采集柱或特異性G蛋白質(zhì)分析色譜柱監(jiān)測收獲工藝[18]。

6 下游工藝研究應用

生物技術(shù)產(chǎn)品下游加工常用的純化操作包括復性、層析、過濾和制備色譜等，整個處理過程由若干個目的明確的操作單元組成，相互影響。本工藝流程對產(chǎn)品質(zhì)量一致性具有重要影響，因此對每個步驟適當?shù)目刂埔约皩φ麄€工藝的連續(xù)性評估監(jiān)測，顯得非常重要。生物藥物的穩(wěn)定性受pH、溫度、離子強度、提取過程所使用的溶劑和表面活性劑、金屬離子等方面的影響，相對分子質(zhì)量越大，穩(wěn)定性就越差。因此，在分離純化過程中，條件應當溫和。由于層析等純化操作與下一步工藝的間隔時間相對于檢測時間而言比較短暫，因此PAT在下游工藝中的應用難度更大。

常用的PAT方法，是通過在線液相色譜分析技術(shù)、NIR分析技術(shù)檢測目標生物藥物純度變化，建立純化終點判斷方法，優(yōu)化藥物純化工藝，提高生物藥的得率，減少純化過程中生物藥的活性破壞。如純化過程中使用在線超高效液相色譜（UPLC）組合可提升單抗純度（由99.1%提升為99.3%）及產(chǎn)量（由62.4%提升為62.9%）[19]。單抗藥物純化過程中使用在線疏水層析技術(shù)，相對于離線柱分離，純度更高，均一性更好，偏差由0.16%降低為0.03%[20]。

另外也有一些PAT新方法的研究。Durous等[21]利用表面等離子共振成像技術(shù)（SPRi）測定病毒顆粒量，該法穩(wěn)定可靠，可用于流感疫苗制備和純化過程實時監(jiān)測。Ladd Effio等[22]采用反向體積排阻-超高效液相色譜技術(shù)（iSE-UHPLC）對多種疫苗病毒樣顆粒（VLP）的表征進行快速精確的檢驗，該法用于監(jiān)測VLP聚合物純化工藝，是一個穩(wěn)定而有效的PAT工具。Tseng等[23]利用電噴霧差示遷移分析技術(shù)（ES-DMA）測定蛋白類藥物濃度、分子尺寸，該技術(shù)作為一個潛在的PAT工具被用于病毒清除、蛋白聚集等純化過程中。Yu等[24]利用動態(tài)光散射技術(shù)（DLS）監(jiān)測重組蛋白疫苗包涵體（IB）增溶、蛋白復性和聚集過程，該技術(shù)是一種潛在的在線PAT工具。

7 成品制備研究應用

生物制品中配制、灌裝是質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，利用光譜分析技術(shù)對生物藥配制灌裝后進行瓶內(nèi)真空度在線檢測，篩選出密封不佳的制劑，從而提高制劑分裝的合格率，避免因密封性不佳導致藥品在儲藏、物流過程中效價下降的情況發(fā)生。一般生產(chǎn)過程中由于常規(guī)微生物檢驗周期太長，導致生產(chǎn)過程監(jiān)測和藥品出廠檢驗在產(chǎn)品放行評價方面具有局限性，而不能及時指導生產(chǎn)過程。瞬時微生物檢測光譜技術(shù)可以測定存在于液體或空氣中粒子的數(shù)量和大小，同時還能檢測出每個粒子是否具有生物活性，并且這些工作都是瞬間完成。通過抽樣連續(xù)監(jiān)控生產(chǎn)過程，當微生物數(shù)達到警戒值時，及時采取補救措施，同時依據(jù)實時反饋數(shù)據(jù)，驗證補救措施是否成功。通過此項技術(shù)的研究進而減少生物藥品被微生物污染的風險，并縮短藥品出廠周期。

藥品制備步驟中，將輔料和活性藥物等配制起來，制成最終的配方。為增加生物制品穩(wěn)定性，最后一步往往通過凍干流程實現(xiàn)。一個良好的凍干工藝，應具有產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、時間短、能耗低、凍干周期可控、可驗證的特征。由于這一工藝步驟對最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響很大，以及該步驟對各種環(huán)境條件敏感，凍干一直是許多PAT應用的焦點。在藥品凍干過程中，監(jiān)控溫度以及準確判斷一次升華干燥和解析干燥結(jié)束點是凍干工藝中需要控制的關(guān)鍵。傳統(tǒng)方法建立在經(jīng)驗和反復實驗基礎(chǔ)上，而現(xiàn)代凍干方法建立在工藝設(shè)計、科學實驗和風險評估基礎(chǔ)上，如利用差示掃描量熱儀、冷凍顯微鏡、氣相色譜、液-質(zhì)聯(lián)用儀、近紅外光譜以及激光調(diào)頻光譜儀等，通過不斷優(yōu)化驗證，實施過程控制，獲取理想凍干曲線，用于凍干方法開發(fā)、品質(zhì)控制等[25]。

在凍干工藝的PAT應用中，常用的傳感器包括熱流傳感器、無線溫度傳感器、熱電偶溫度傳感器（TC）、電阻式溫度傳感器（RTD）。常用的技術(shù)方法包括動壓測溫技術(shù)、可調(diào)諧半導體激光吸收光譜（TDLAS）技術(shù)、無線溫度測控系統(tǒng)（TEMPRIS）、在線稱重法、壓力比值法[26]。運用氣體質(zhì)譜分析技術(shù)和低溫等離子體激發(fā)光子分析技術(shù)，可以實時監(jiān)測凍干過程，準確測定出氣體成分和藥物的相對殘余含水量，并判斷一次干燥和二次干燥終點，以及系統(tǒng)受污染或外界泄漏程度。Awotwe Otoo等[27]利用ControLyoTM成核技術(shù)和TDLAS技術(shù)控制單抗制品凍干中冰核形成，檢測一次干燥過程中水氣濃度和流速，其作為非侵入式在線PAT工具，可對凍干工藝進行實時監(jiān)控。

8 結(jié)語

國外部分企業(yè)已將PAT成功應用于生物制品生產(chǎn)過程，國內(nèi)在藥物生產(chǎn)過程中的PAT研究也逐漸取得較大的觀念突破，正在從生產(chǎn)質(zhì)量一致性與QbD理念角度提升科學管理和風險管理能力。然而，實施PAT需要更高層次的工藝理解，這需要投入更多的時間和資源。圖2展示了生物制品操作單元中PAT工具應用的難易程度[18]，挑選了部分常規(guī)代表性步驟，以下一步工藝間隔時間與本步驟檢測時間比值相對性為例，其中層析流程PAT應用上相對較難，離心流程則相對一般，而在微生物發(fā)酵、復性、灌裝、配制、細胞培養(yǎng)、凍干等流程中，PAT的應用相對容易。

Nordon等[28]將PAT應用分為5個級別：1）通過光譜技術(shù)測定成分的濃度和其他性質(zhì)；2）原材料質(zhì)量檢驗及光譜數(shù)據(jù)分類；3）采用多元測量途徑監(jiān)測批次過程；4）利用批次監(jiān)測數(shù)據(jù)和過程信息預測產(chǎn)品質(zhì)量；5）通過對過程的反饋控制，保持產(chǎn)品質(zhì)量。

據(jù)觀察，盡管在我國生物醫(yī)藥行業(yè)，分析監(jiān)測關(guān)鍵工藝和質(zhì)量屬性的能力方面（1～3級）取得了重大進展，但在利用收集到的數(shù)據(jù)進行后續(xù)工藝控制、實現(xiàn)最佳產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量方面仍有更多工作要做。從以上研究內(nèi)容中可見，各方一直致力于生物醫(yī)藥PAT的應用融合。PAT加深了企業(yè)對生產(chǎn)過程的理解，提高了藥品生產(chǎn)效率，加強質(zhì)量均一穩(wěn)定性，可以相信，后期將有更多的PAT應用投入到生物醫(yī)藥行業(yè)，并給企業(yè)帶來良好的經(jīng)濟效益。

圖2 生物制品常規(guī)操作單元中PAT工具應用的難易程度Figure 2 The difficult degree in the application of PAT tools in conventional operation units for biological products