林碧惠 簡(jiǎn)詠芬 蔡艷 范徐威 楊燕華 王翠敏

腦膜炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受細(xì)菌、真菌、病毒等感染后出現(xiàn)的軟腦膜組織的彌漫性炎性疾病，根據(jù)致病因素的不同，可分為細(xì)菌性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎、病毒性腦膜炎和真菌性腦膜炎[1,2]。在兒童腦膜炎患者中，以細(xì)菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎最為常見，真菌性腦膜炎發(fā)病率最低[3,4]。腦膜炎患兒在發(fā)病早期通常表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、惡心、嘔吐，及不同程度精神、人格或意識(shí)改變等，不具備典型性臨床癥狀，且目前的主要診斷手段是依靠腦脊液化學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)鑒定，以及配合利用頭顱放射影像學(xué)、腦電圖等[5]。然而對(duì)于腦膜炎患兒，放射學(xué)、腦電圖等檢查手段往往不能配合，給診斷帶來(lái)一定的障礙。

由于兒童的各類腦膜炎單純依靠臨床表現(xiàn)和早期缺乏細(xì)菌培養(yǎng)等檢查結(jié)果，無(wú)法做出病因診斷，因此臨床早期經(jīng)驗(yàn)性選擇抗生素進(jìn)行治療，對(duì)病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎及真菌性腦膜炎等不能覆蓋，造成治療方案的錯(cuò)誤甚至錯(cuò)過診療的最佳時(shí)機(jī)，患兒容易留下肢體活動(dòng)障礙、智力障礙，甚至因治療延誤導(dǎo)致死亡[6]。如何于早期更好地明確兒童腦膜炎的病因類型是目前重點(diǎn)的研究方向。大量研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、病毒及真菌所致的腦膜炎早期腦脊液的成分就能出現(xiàn)很大的差別，表現(xiàn)在腦脊液蛋白、干擾素、白介素等。近期研究發(fā)現(xiàn)，有系列腦脊液miRNA（如miRNA-125b、miRNA-29a、miRNA-155等）在不同病原菌所致的腦膜炎中呈現(xiàn)不同程度的水平及變化趨勢(shì)，與結(jié)核性腦膜炎有明顯相關(guān)性，miRNA-31 與隱球菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎有相關(guān)性等[7-9]。miRNA-22 是一種炎癥相關(guān)的小分子RNA，本研究圍繞腦膜炎病原學(xué)類型鑒別，其在腦脊液中水平與疾病的臨床發(fā)展、診療效果的相關(guān)性報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

選取佛山市南海區(qū)婦幼保健院自2015 年1 月至2018 年3 月收治的82 例腦膜炎患兒和和佛山市第二人民醫(yī)院同期收治的44 例腦膜炎患兒，其中男性65 例、女性61 例，年齡范圍3～15 歲，年齡（8.54±3.52）歲，根據(jù)最終診斷結(jié)果分為3 組：細(xì)菌性腦膜炎組（64 例）、病毒性腦膜炎組（44 例）、結(jié)核性腦膜炎組（18 例）。其中，細(xì)菌性腦膜炎組中，男性33 例，女性31 例，年齡范圍3～15 歲，年齡（8.48±3.58）歲；病毒性腦膜炎組中，男性24 例，女性20 例，年齡范圍4～15 歲，年齡（8.68±3.51）歲；結(jié)核性腦膜炎組中，男性8 例，女性10 例，年齡范圍4～15 歲，年齡（8.39±3.52）歲。各組間患兒在性別構(gòu)成、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

二、納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院時(shí)均為輕型腦膜炎，無(wú)需急救處理；（2）入院時(shí)為初診，未經(jīng)過外院治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并免疫缺陷性疾病患兒；（2）近半年來(lái)有大劑量使用激素類藥物或免疫球蛋白制劑患兒；（3）診斷考慮為混合感染型腦膜炎患兒；（4）重型腦膜炎患兒，需要ICU 治療的。研究各項(xiàng)操作均得到患者家屬的同意并簽字，項(xiàng)目的開展得到了本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審批并同意開展。

三、標(biāo)準(zhǔn)治療方案下治療效果分型

細(xì)菌性腦膜炎患兒根據(jù)治療效果分為3 級(jí)：（1）滿意：患者經(jīng)治療后癥狀明顯改善，第5 天時(shí)無(wú)明顯不適，一般情況良好；（2）一般：患者經(jīng)治療后癥狀有較大改善，第5 天時(shí)仍有輕微腦膜炎癥狀，一般情況尚可；（3）欠佳：患者經(jīng)治療后稍有改善，第5 天時(shí)仍有輕至中度腦膜炎臨床癥狀，一般情況稍差。

四、腦脊液miRNA-22 的拷貝數(shù)測(cè)定

通過腰穿獲得的腦脊液標(biāo)本5 mL，通過miRVanaTMPARIS 試劑盒（Ambion 公司，美國(guó)）提取樣本內(nèi)總RNA，RNA 的擴(kuò)增和定量采用生物光譜儀測(cè)定。每個(gè)樣本通過miRNA-22 特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR），獲得cDNA，通過RT-PCR 檢測(cè)拷貝數(shù)。具體方法如下：使用TRIzol 從腦脊液樣本中提取總RNA，然后使用Hairpin-itTMmiRNAs qPCR 定量試劑盒（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）在PCR 儀器上檢測(cè)miRNA-22 的相對(duì)表達(dá)量。PCR 循環(huán)程序：95℃持續(xù)30 s，隨后95℃持續(xù)5 s，60℃持續(xù)30 s，40 個(gè)循環(huán)[10]。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，2 組組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、3 組患兒不同時(shí)間點(diǎn)腦脊液miRNA-22 水平比較及變化趨勢(shì)分析

相較于病毒性腦膜炎和結(jié)核性腦膜炎患兒，細(xì)菌性腦脊液患兒治療前miRNA-22 的拷貝數(shù)明顯更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)菌性腦膜炎組經(jīng)過治療后，腦脊液miRNA-22 的水平呈現(xiàn)快速下降的趨勢(shì)，且細(xì)菌性腦膜炎患者與病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎患兒治療后腦脊液miRNA-22 的拷貝值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 不同病因組腦膜炎患兒腦脊液水平miRNA-22在不同時(shí)間點(diǎn)的拷貝數(shù)比較

二、細(xì)菌性腦膜炎患者不同治療效果組間miRNA-22 拷貝數(shù)比較

細(xì)菌性腦膜炎組患兒入院時(shí)腦脊液miRNA-22水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但療效越差患兒入院時(shí)miRNA 的水平更高。療效滿意的細(xì)菌性腦膜炎患兒的腦脊液miRNA-22 的拷貝數(shù)明顯較療效一般和欠佳的患兒更低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，圖2）。說(shuō)明miRNA-22 水平一定程度上反應(yīng)了患兒的病情程度。

圖2 細(xì)菌性腦膜炎患兒不同療效組間miRNA-22水平比較

討論

兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染是臨床常見的兒科疾病，尤其是2～4 歲兒童，免疫功能的不完善、病源環(huán)境的接觸容易引起爆發(fā)性腦膜炎發(fā)作，對(duì)兒童的身心健康帶來(lái)很大的危害。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染根據(jù)致病菌的不同，主要分為細(xì)菌性腦膜炎、病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎和真菌性腦膜炎，以細(xì)菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎最為常見[11]。其中，細(xì)菌性腦膜炎臨床上又稱為化膿性腦膜炎，主要致病菌為化膿性細(xì)菌，常見為腦膜炎雙球菌、肺炎球菌和流感嗜血桿菌，通常通過身體其他部位感染經(jīng)血途徑侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，或外傷、顱腦臨近部位如中耳炎、鼻竇炎等化膿性細(xì)菌的直接侵犯，少數(shù)情況下因醫(yī)源性操作引起的化膿性細(xì)菌侵入等途徑引發(fā)顱內(nèi)化膿性改變[12]。這類腦膜炎發(fā)病率最高，同時(shí)其病死率和治療后后遺癥的發(fā)生率也最高。對(duì)于病毒性腦膜炎，常見的致病病毒為腸道病毒，如柯薩奇病毒A/B、脊髓灰質(zhì)炎病毒和埃可病毒，其次為單純皰疹病毒、流行性腮腺炎病毒和腺病毒[13]。結(jié)核桿菌性腦膜炎顧名思義為特別致病菌結(jié)核桿菌引起的腦脊膜、蛛網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng)[14]。真菌性腦膜炎是由真菌感染引起的，中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染引起的腦脊髓蛛網(wǎng)膜炎癥通常同時(shí)合并有腦實(shí)質(zhì)病變，其發(fā)病率相對(duì)較低，但目前臨床上抗生素的濫用、大量激素的不規(guī)范使用及艾滋病高發(fā)導(dǎo)致真菌性腦膜炎的發(fā)病率逐年增高[15]。各類病原菌所致的小兒腦膜炎發(fā)病的早期通常均表現(xiàn)為發(fā)熱，精神、意識(shí)改變，頭痛、惡心、嘔吐等，無(wú)明顯特征，對(duì)病因?qū)W診斷無(wú)明顯幫助。目前臨床診斷常常需要進(jìn)行腦脊液的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)及鑒定，但是獲得結(jié)果需要花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，且病毒性腦膜炎、真菌性腦膜炎等常出現(xiàn)陰性結(jié)果[16]。因此，小兒腦膜炎患者早期的治療通常為進(jìn)行廣譜強(qiáng)力抗生素的覆蓋，以期待達(dá)到對(duì)發(fā)病率最高的化膿性腦膜炎的控制，然而對(duì)真菌性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎、病毒性腦膜炎患兒，不可避免地出現(xiàn)耽誤治療的情況。

對(duì)腦膜炎患者的早期病原菌型診斷是臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)重點(diǎn)之一，研究也發(fā)現(xiàn)了大量線索能夠?qū)υ缙诓≡姆中偷拇_定起到重要指導(dǎo)。外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、降鈣素原、C 反應(yīng)蛋白是常用的炎癥指標(biāo)，其濃度異常升高對(duì)化膿性腦膜炎的診斷有一定的指導(dǎo)意義，但以上指標(biāo)外界影響因素大，診斷的特異度和敏感度不夠理想，且對(duì)非化膿性腦膜炎的病原菌分型的確定無(wú)明顯意義[17]。相比較血清學(xué)檢查，腦脊液的生化檢查對(duì)腦膜炎患者病原菌的診斷意義更加明確。腦膜炎患者因病原菌的不同，腦脊液內(nèi)蛋白、細(xì)胞因子以及病原菌表達(dá)的miRNA 等可表現(xiàn)出一定的濃度、變化趨勢(shì)的特殊性，為病原學(xué)診斷提供了線索[18]。miRNA 是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，通常以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在。其在細(xì)胞的增殖、凋亡，細(xì)胞的分化、遷移，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等各種生理生化過程中具有重要的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦脊液中，也能檢測(cè)到miRNA 的存在，且含量的變化與某些疾病有著密切的關(guān)系[19]。miRNA-22 在機(jī)體內(nèi)有重要的作用，其高表達(dá)能夠改善心肌梗死后心功能情況，也能夠調(diào)控髓母細(xì)胞的增殖、凋亡，在肝癌等癌細(xì)胞中能夠調(diào)控惡性進(jìn)展，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-22 的水平與中樞神經(jīng)退行性病變、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移有一定關(guān)系[20-22]。但目前關(guān)于腦脊液miRNA-22 水平與兒童腦膜炎的病原學(xué)類型是否有關(guān)系尚無(wú)明確報(bào)道。本研究表明miRNA-22在細(xì)菌性腦膜炎患兒腦脊液中的拷貝數(shù)較病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎高，在病毒性腦膜炎患兒腦脊液中的拷貝數(shù)最低，且3 組病原菌型患兒經(jīng)常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)抗菌治療后，細(xì)菌性腦膜炎患兒腦脊液中的miRNA-22 拷貝數(shù)呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)，而在病毒性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎患兒的腦脊液中拷貝數(shù)無(wú)明顯變化。通過進(jìn)一步分析細(xì)菌性腦膜炎患兒組內(nèi)不同治療效果的差異與腦脊液中miRNA-22 拷貝數(shù)的差異變化發(fā)現(xiàn)，治療效果滿意患兒的腦脊液中miRNA-22 的拷貝數(shù)在治療后的下降趨勢(shì)顯著大于治療效果一般和欠佳的患者。

綜上所述，腦膜炎患兒腦脊液中miRNA-22 拷貝數(shù)的水平對(duì)早期區(qū)分腦膜炎患兒病原菌的類型有一定的參考價(jià)值，細(xì)菌性腦膜炎患兒腦脊液中的miRNA-22 拷貝數(shù)明顯升高，且miRNA-22 拷貝數(shù)與細(xì)菌性腦膜炎患兒的預(yù)期治療效果可能存在一定相關(guān)性，需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。