丁興杰 蒲忠慧 熊 亮郭 力劉 菲?彭 成?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都611137；2.西南特色藥材創(chuàng)新藥物成分研究所，四川 成都611137）

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，其味辛、甘，性大熱，有毒，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效。附子多糖是附子有效成分之一，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、保護心肌細胞、降血脂等作用［1］，近年來越來越受到重視［2-4］，目前相關(guān)工藝研究主要集中在提取上［5-7］，鮮有純化方面的報道。

透析法作為多糖經(jīng)典的除小分子化合物方法，能有效提高附子多糖純度，而且損失較少。本實驗首次采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化附子多糖純化工藝，并進行毒性研究，以期為該成分開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 試藥 生附片（產(chǎn)地四川江油）購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高繼海副教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品。無水葡萄糖對照品（批號110833-200302，中國食品藥品檢定研究院）。中性蛋白酶（批號16110902，南寧龐博生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（如吉生物科技有限公司）。95%乙醇、蒽酮、硫酸均為分析純（成都科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器 Lambda 35型紫外-可見分光光度計；LDZ5-2型離心機；DSY-1-6型電熱恒溫水浴器；電子分析天平（萬分之一，德國Sartorius 公司）；DB-211SC 型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱；MD34型透析袋（8 000～14 000 Da，美國Viskase 公司）；24孔板；移液槍。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.1.1 葡萄糖 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得（1 mg／mL）。

2.1.2 蛋白質(zhì) 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的牛血清白蛋白對照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得（1 mg／mL）

2.1.3 二硝基水楊酸（DNS）精密稱取DNS 0.65 g，適量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色量瓶中，依次加入NaOH 溶液（2 mol／L）32.5 mL、丙三醇4.5 g，定容，搖勻，放置7 d，即得。

2.1.4 考馬斯亮藍 精密稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg，依次加入95%乙醇50 mL、85%磷酸100 mL，蒸餾水定容至1 000 mL，即得，置于棕色瓶中備用。

2.2 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用苯酚-硫酸法。精密吸取“2.1.1”項下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、40、60、80、100、120 μL，置于試管中，蒸餾水定容至1.5 mL，再加入5%苯酚2 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸6.5 mL，室溫下顯色25 min；另取蒸餾水2 mL，同法顯色，作為空白對照，于最大吸收波長488 nm 處測定吸光度。以總糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進行回歸，得方程A=63.75X＋0.018（r=0.999 9），在0.004～0.012 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用DNS 法。精密吸取“2.1.1”項下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于比色管中，蒸餾水定容至1 mL，再加入“2.1.3”項下DNS 試劑2 mL，搖勻，沸水浴3 min，加純水17 mL，于最大吸收波長495 nm 處測定吸光度。以還原糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進行回歸，得方程A=21.72X-0.046（r=0.999 9），在0.015～0.035 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

“股份制”合作統(tǒng)一經(jīng)營模式使橫溪塢村竹林逐步走向規(guī)?；?、集約化、效益化、品牌化的現(xiàn)代林業(yè)經(jīng)營道路，實現(xiàn)了生態(tài)、經(jīng)濟、社會效益的和諧統(tǒng)一，對當(dāng)?shù)剜l(xiāng)村振興發(fā)揮了更為積極有效的作用。

2.4 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用考馬斯亮藍法。精密吸取“2.1.2”項下蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、40、60、80、100、120 μL，置于試管中，蒸餾水定容至1 mL，再加入“2.1.4”項下考馬斯亮藍溶液5 mL，顯色15 min，于最大吸收波長590 nm 處測定吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進行回歸，得方程A=52.6X＋0.092（r=0.999 9），在0.004～0.012 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 純化工藝 采用單因素試驗，確定提取工藝為5 g 藥材粗粉加40倍量水煎煮4 h，過濾，濾液離心，上清液加80%乙醇醇沉，低溫放置過夜，離心，沉淀用水復(fù)溶，Sevage 法除蛋白后用透析膜透析。然后，通過苯酚硫酸法、DNS 法［8］測定多糖含有量。

2.5.1 醇沉體積分?jǐn)?shù)對多糖損失率的影響 取藥材粗粉5 g，加40倍量水，100 ℃下回流煎煮4 h，離心，取上清液，加乙醇至50%、60%、70%、80%、90%，靜置過夜，離心，加水復(fù)溶，測定多糖含有量，結(jié)果見圖1。由圖可知，醇沉體積分?jǐn)?shù)80%時多糖損失率最低。

圖1 醇沉體積分?jǐn)?shù)對多糖損失率的影響

2.5.2 除蛋白方法對多糖含有量的影響 蛋白質(zhì)是粗多糖中最主要的雜質(zhì)，其存在增加了多糖吸濕性，而且所帶電荷可吸附大量其他雜質(zhì)和多糖，導(dǎo)致難以去除或分離［9］。取適量多糖溶于水，離心去沉淀，上清液分別用Sevage 試劑、三氟乙酸、中性蛋白酶除蛋白，考馬斯亮藍法檢測蛋白質(zhì)含有量，結(jié)果見圖2。由圖可知，雖然三氟乙酸法可將蛋白質(zhì)除盡，但也會使多糖大量降解；酶法雖也可除盡蛋白質(zhì)，但多糖含有量也較低，綜合考慮，選擇Sevage 法去除蛋白質(zhì)。

圖2 除蛋白方法對多糖含有量的影響

2.6 透析工藝 通過MD34透析袋（8 000～14 000 Da）對多糖進行透析后，對透析時間、透析溫度、換液次數(shù)進行單因素考察［10］。

2.6.1 透析時間 固定透析液-緩沖液體積比1 ∶50，更換緩沖液4次，透析溫度20 ℃，考察透析15、20、25、30、35 h 對多糖純度的影響，結(jié)果見圖3。由圖可知，透析30 h時多糖純度最高。

圖3 透析時間對多糖純度的影響

圖4 透析溫度對多糖純度的影響

2.6.3 換液次數(shù) 固定透析液-緩沖液體積比1 ∶50，透析時間30 h，透析溫度40 ℃，考查換液3、4、5、6、7次對多糖純度的影響，結(jié)果見圖5。由圖可知，隨著換液次數(shù)增加，多糖純度逐漸提高，在6次時最高，但在7次時反而稍有降低，可能是由于換液頻繁會使小分子聚合糖流失。

圖5 換液次數(shù)對多糖的影響

2.6.4 工藝優(yōu)化 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，選擇透析溫度（A）、透析時間（B）、換液次數(shù)（C）作為影響因素，多糖純度（Y）作為評價指標(biāo)，進行3因素3水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表1。

表1 試驗設(shè)計及結(jié)果

然后，應(yīng)用Design Expert 8.0.6.1軟件對表1數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得方程Y=-270.689 00 ＋3.451 45A＋6.200 10B＋64.378 00C-0.029 300AB＋0.024 500AC＋0.100 00BC-0.035 390A2-0.093 360B2-5.439 00C2，方差分析見表2。由表可知，模型具有顯著性（P＜0.05），而失擬項不顯著（P＞0.05）；各因素影響程度依次為換液次數(shù)＞透析溫度＞透析時間；回歸方程擬合度和可信度均較高（R2=0.901 5，=0.884 6），預(yù)測性良好。

表2 方差分析

2.7 響應(yīng)面分析 通過Design Expert 8.0.6.1軟件繪制響應(yīng)面，見圖6。由圖可知，最優(yōu)工藝為透析溫度36 ℃，透析時間31 h，換液次數(shù)6次，多糖純度為92.17%。

圖6 各因素響應(yīng)面圖

2.8 驗證試驗 取藥材粗粉5 g，加40倍量水，100 ℃下回流煎煮4 h，離心，取上清液，加乙醇至80%靜置過夜，離心，加水復(fù)溶，Sevage 法除蛋白，在透析溫度36 ℃、透析時間31 h、換液次數(shù)6次條件下進行多糖透析，冷凍干燥，得無色透明膠狀多糖，稱定質(zhì)量，重復(fù)3次。結(jié)果，多糖提取率分別為9.64%、9.92%、9.58%，平均9.71%（RSD=1.85%）；純度分別為90.26%、92.71%、92.70%，平均91.89%（RSD=1.54%），與理論值92.17% 相當(dāng)，表明工藝優(yōu)化效果理想。

2.9 多糖毒性研究

2.9.1 心臟毒性 斑馬魚按雌雄比2 ∶1或1 ∶1的比例放入配魚缸中，次日早上利用光照刺激使其交配，待其產(chǎn)卵0.5～1 h 后，收集受精卵于胚胎培養(yǎng)液中，置于28.5 ℃孵箱中孵育48 h，其間每天更換胚胎培養(yǎng)液并棄除死卵，隨機分組放入24孔板中，每孔10只，分為多糖6.25、12.5、25、50、100 μg／mL 組和空白組，浸泡給藥后，斑馬魚繼續(xù)放入28.5 ℃孵箱中孵育。每12 h 觀察1次，記錄0.5 min內(nèi)心跳次數(shù)，同時觀察胚胎心包及心臟形態(tài)，重復(fù)3次，每次用同一批胚胎，結(jié)果見圖7。由圖可知，不同質(zhì)量濃度多糖對斑馬魚心率均無明顯影響（P＞0.05）。

圖7 多糖對斑馬魚心率的影響

2.9.2 胚胎毒性 選擇受精后10 h 發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，隨機分組放入24孔板中，每孔10枚胚胎，分為多糖6.25、12.5、25、50、100 μg／mL 組和空白組，浸泡給藥后，胚胎繼續(xù)放入28.5 ℃孵箱中孵育，每12 h 觀察1次，記錄胚胎死亡率，重復(fù)3次，每次用同一批胚胎，結(jié)果見圖8。由圖可知，不同質(zhì)量濃度多糖對斑馬魚胚胎死亡率均無明顯影響（P＞0.05）。

圖8 多糖對斑馬魚胚胎死亡率的影響

3 討論

傳統(tǒng)多糖含有量測定方法大多為苯酚-硫酸法或蒽酮-硫酸法［11-12］，這是因為多糖醇沉后還原糖含有量可忽略不計，但在除蛋白過程中，各種試劑會造成多糖降解而產(chǎn)生還原糖，三氟乙酸法、中性蛋白酶除蛋白均是如此。由于多糖透析的目的是除去小分子還原糖，故本實驗采用苯酚-硫酸法、DNS 法測定多糖含有量。

Box-Behnken 響應(yīng)面法是近年來發(fā)展起來的一種新的多變量統(tǒng)計分析技術(shù)［13］，可應(yīng)用于多變量統(tǒng)計學(xué)分析，能對幾個因素的相互影響作出全面統(tǒng)計學(xué)分析，通過對擬合后的回歸方程進行分析，以尋找最優(yōu)工藝參數(shù)，而且，它可更好地處理離散水平值，具有試驗數(shù)相對較少、精密度高等優(yōu)點，能對各因素之間的交互作用進行研究［14］。本實驗采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化附子多糖純化工藝，不僅使多糖透析時間降低到31 h，比傳統(tǒng)工藝下的72 h 縮短一半以上，還將其純度提升到91.89%，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附子具有回陽救逆、補火助陽的功效，但有大毒。本實驗考察了附子多糖毒性，發(fā)現(xiàn)該成分無明顯心臟、胚胎毒性，安全性高，可為其開發(fā)利用提供參考。